论文部分内容阅读
目的：1.探讨肺间质树突状细胞(DCs)的免疫表型及功能变化在MODS模型早期过度炎症反应和晚期免疫抑制中的作用。2.证实MODS期肺间质DCs存在免疫耐受现象,探讨DCs负向调节作用对肺组织损伤的影响。3.应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和Flt3配体(Flt3L)分别针对MODS早期过度炎症和晚期免疫抑制中DCs功能进行实验性干预调节,观察减轻肺组织损伤和改善脏器功能的效果。方法：腹腔注射酵母多糖复制Balb／c小鼠MODS模型。主要实验分组：急性损伤组(n=30)：酵母多糖注射后48h取材；NAC治疗组(n=30)：酵母多糖注射后3h、6h、12h、18h、24h、36h皮下注射NAC(100mg／kg体重),48h取材；MODS组(n=30)：酵母多糖注射后10d取材；Flt3L治疗组(n=20)：酵母多糖注射后48h开始每日皮下注射rFlt3L(10μg／只,连续注射7d),第10d取材；对照组(n=20)：以等量生理盐水替代酵母多糖和NAC或rFlt3L按上述时间注射。每组小鼠按不同时间点麻醉后摘眼球取血,肺血管灌注,摘取双侧肺,按不同实验分别进行固定、超低温冻存、酶消化或匀浆处理。自动生化分析仪检测CO2、ALT、AST、Cr等血生化指标。生化法检测肺组织MPO活性。ELISA法检测血清和肺组织匀浆TNF-α含量。光镜观察肺组织病理变化,CD205免疫组化和CD11c免疫荧光标记肺间质DCs。密度梯度离心分离肺低密度单个核细胞,MACS磁珠分选DCs,流式细胞术进行DCs鉴定和免疫表型分析(I-Ad、CD86、PD-L1)。扫描和透射电镜观察DCs的超微形态。凝胶电泳迁移率变动分析法检测DCs胞核内NF-κB含量和活性。Real-time PCR检测DCs的CCR5/CCR7mRNA表达。体外LPS刺激DCs,ELISA法检测DCs孵育上清液细胞因子IL-12p70和IL-10含量。结果：1.正常Balb／c小鼠肺间质DCs分为三个亚群：髓系CD11c+CD11b+DCs、类浆系CD11c+CD45R＼B220+DCs、淋巴系CD11c+CD11b-／CD45R＼B220-DCs,分别占肺单个核细胞比例的6.35%、1.96%、3.21%。肺间质DCs高表达髓系标志物CD11b(39.59%),低表达MHC-Ⅱ／Ⅰ-Ad(8.97%)和共刺激分子CD86(3.16%)。DCs表面见长1-2μm树枝状突起,细胞器不发达,未见各级溶酶体和吞噬颗粒,细胞核形状不规则。2.急性损伤组(与对照组比较),血CO2含量降低,肺组织和血清TNF-α水平显著上升。肺含水量增加,肺组织MPO活性显著增高。肺间质CD11c+DCs数量增加,DCs体积增大,表面突起增多、变长。DCs表面I-Ad和共刺激分子CD86表达显著增高,趋化因子受体CCR5表达显著增加,CCR7表达轻度升高。DCs的NF-κB胞核内转移和活性增加。3.NAC治疗组(与急性损伤组比较),肺含水量、肺组织MPO活性和TNF-α水平明显降低,血CO2含量升高,DCs的NF-κB细胞核内转移和活性降低,DCs表面I-Ad和CD86表达降低,CCR5和CCR7表达下降。实验鼠急性损伤期死亡率降低20%。4.MODS组,血清ALT、AST、脂肪酶、淀粉酶和肌苷水平较对照组显著升高,血葡萄糖水平明显下降。肺间质髓系与类浆系DCs亚群比例及CD205+DCs数量较对照组明显降低,而淋巴系DCs比例明显升高。DCs表达I-Ad和CD86较对照组和急性损伤组明显下降,DCs表达耐受性分子PD-L1增高十分显著。电镜下DCs多呈退变与凋亡改变。在体外实验LPS刺激后,DCs分泌IL-12p70水平较对照组和急性损伤组明显下降而IL-10水平显著升高。5.Flt3L治疗组(与MODS组比较),髓系和类浆系DCs亚群比例较MODS组明显增加,淋巴系DCs比例降低。DCs表达I-Ad+、CD86及CD205+DCs数量较MODS组显著增加,DCs表达PD-L1明显下降。体外LPS刺激后,DCs分泌IL-12p70水平显著回升。肺组织损伤明显减轻,血清ALT、AST和肌苷水平较MODS组均有明显下降,血糖水平上升。实验鼠MODS期死亡率降低12%。结论：1．利用密度梯度离心和免疫磁珠分离、纯化肺间质DCs,获得DCs纯度高,活性良好,免疫表型稳定,但操作步骤复杂,技术要求较高。2.MODS急性损伤期,肺间质DCs大量成熟活化导致免疫应答反应亢进和炎症反应失控。肺间质DCs功能紊乱是引起肺过度炎症损伤的主要免疫细胞学因素。3.N-乙酰-L-半胱氨酸体内干预能够降低肺间质DCs的NF-κB胞核内转移和活性,从而抑制DCs分化成熟和趋化迁移,减弱炎症反应,进而减轻MODS急性损伤期的肺组织损伤。4.MODS期,肺间质DCs活性减低(表达I-Ad和CD86比例下降),发生免疫耐受(DCs表达PD-L1显著升高),并通过大量分泌IL-10发挥负向免疫调节作用。DCs的免疫耐受作用参与诱导和促进了免疫抑制与肺功能衰竭。5.Flt3L体内扩增DCs作用能够增加肺间质髓系和类浆系DCs亚群及成熟DCs比例,致DCs分泌IL-12p70增加,正向免疫调节作用增强。Flt3L可以明显逆转MODS期肺间质DCs的免疫耐受状态,进而减轻肺组织损伤和改善脏器功能。