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转基因动物技术是一项新兴的生物技术,是常规分子生物学技术和基因工程技术在研究层次上的拓展和延伸。转基因动物的出现,使人类可以通过基因重组的各种方法人为的改造动物基因组,在动物活体水平上研究有关基因的结构与功能,是一个四维时空的研究体系,为从分子到个体的各个层次,多维的研究基因提供了新的方法和思路。转基因动物研究揭开了生命科学研究的新篇章,其多样性和重复性差也反映了客观世界的复杂性和多样性,为人类提供了更多展示自然规律的途径,显示出美好的应用前景。
血清淀粉样p物质(serumamyloidpcomponent,SAP)作为一种古老的蛋白质,与C反应蛋白(CRP)构成血清正五聚体蛋白家族,其系统发生学非常保守,具有重要的生理功能,与炎症、凝血及多种淀粉样病变有关。
小鼠与人基因同源性较高,小鼠的许多疾病模型与人类同种疾病有着较高的可比性,这为人类研究疾病及某个基因的功能提供了一条新的途径。因此我们设计本实验,通过受精卵原核显微注射法将外源基因导入动物体内,该方法首先由英国的Clark为首的研究小组提出,旨在研究外源基因协同作用以提高其表达水平。
本研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,RT-PCR获得小鼠SAP基因,将其正向插入pCMV-Tag5A真核表达载体上,转化宿主菌,挑选克隆,抽提质粒,用BamHI和XHoI双酶切鉴定出阳性克隆后,经测序正确。然后借助受精卵原核显微注射法将经BciVI限制性核酸内切酶酶切后回收的2.7kb线性片断导入C57×CBAF1代小鼠受精卵雄原核,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鉴定获得10只转基因阳性小鼠,整合率为7.87%。然后遵循孟德尔遗传规律PCR鉴定F1、F2、F3代所生小鼠,建立三个转基因纯合子founder,最终借助免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹法(Westernblotting,WB)在蛋白水平上确定了两个纯合子founder小鼠。成功建立了小鼠血清淀粉样p物质转基因小鼠纯合子模型,为今后研究该基因的功能提供了良好的实验素材,也为转基因阳性动物组群繁育提供了科学资料。