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溶藻弧菌是水产养殖中常见的致病菌,在自然环境中具有极强的环境适应性,其多变的环境适应需要通过复杂的基因调控网络来实现,越来越多的研究表明以sRNA为代表的基于RNA的基因表达调控方式是细菌生命活动的重要调节手段。氨基酸作为蛋白质的基本骨架,是几乎所有酶的主要成分,其代谢的精准调控对细菌生命活动具有重要意义。 本论文首先研究了RNA分子伴侣蛋白Hfq对溶藻弧菌的生理生化功能的影响,结果表明hfq缺失后,溶藻弧菌菌落形态变得褶皱,胞外多糖合成减少,在富营养以及单一碳源或氮源的寡营养培养条件下生长减弱,对铜离子、氧化压力敏感性增强,对万古霉素、磷霉素、卡那霉素、妥布霉素以及新霉素的抗生素抗性减弱;野生株和hfq缺失突变株转录组分析发现了313个差异表达基因,这些基因参与了包括碳氮代谢、抗生素抗性、运动以及对胁迫反应等24个不同的生理过程,在基因水平上验证了Hfq泛调控的作用。 通过转录组分析预测得到194个候选sRNAs,利用基因组比对、Northern Blot等技术筛选鉴定到4个新的Hfq依赖的弧菌保守候选sRNAs,分别为misc_RNA_3465、misc_RNA_3945、misc_RNA_2157以及ZGL_3083。通过5和3-RACE(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)获得全转录本序列,并用BPROM、ARNold以及RNA folding进行结构分析,同时通过多序列比对、构建进化树进行进化分析。结果表明,它们的大小分别为108nt,179nt,152nt,313nt;具有典型的茎环结构;5端均存在sigma70启动子,3端均存在Rho-independent转录终止子,misc_RNA_3465、misc_RNA_3945以及ZGL_3083仅存在于弧菌,而misc_RNA_2157几乎存在于所有的革兰氏阴性菌。 成功构建各sRNA的缺失突变株,并对它们进行多种表型测试,结果发现4个候选sRNAs均与溶藻弧菌菌落相变、运动性、胞外蛋白酶、胞外多糖以及抗生素抗性无关,但ZGL_3083影响L-丙氨酸代谢,misc_RNA_2157影响支链氨基酸代谢。 为了对ZGL_3083调控L-丙氨酸代谢的机制进行研究,从溶藻弧菌基因组中筛选得到3个可能与丙氨酸代谢相关的基因。缺失突变发现丙氨酸脱氢酶Ald是溶藻弧菌丙氨酸降解的主要酶类,并很可能是ZGL_3083的调控靶标。EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay,凝胶迁移实验)和sRNA-mRNA相互作用实验表明ZGL_3083在Hfq协助下,与丙氨酸脱氢酶基因(ald)的起始密码子附近区域结合,阻止ald的翻译,抑制ald的表达,从而影响丙氨酸代谢;同时还发现ZGL_3083可回补霍乱弧菌CsrB/CsrC/CsrD的缺失表型,表明ZGL_3083是CsrB类sRNA,可能通过拮抗CsrA蛋白来调控碳源和能量代谢。这些结果表明ZGL_3083可能在溶藻弧菌碳源和氮源代谢网络调控中起“调节开关”作用。 翻译融合发现misc_RNA_2157不是sRNA,而是一个编码序列,其转录本可以翻译成一个由29个氨基酸,其中13个为支链氨基酸的小分子引导肽ilvL。Northern Blot结果表明,ilvL的转录可“读通”(Read-through)ρ因子非依赖的终止子并转录到下游支链氨基酸合成操纵子ilvGMEDA。缺失引导肽ilvL起始密码子(ATG)或读码框架(ORF)后,转录-翻译机制解偶联,衰减子的形成阻止转录达到下游基因;而缺失终止子后,转录复合物可以“读通”整个操纵子,从而促进下游基因的表达,这些结果与大肠杆菌中经典的引导肽-衰减子调控模式一致。但进一步调查发现本论文研究的引导肽-衰减子模式只能单独感受环境中异亮氨酸信号,而当三种支链氨基酸同时存在时,下游结构基因的表达与无支链氨基酸时的表达相比没有显著差异,而且还发现引导肽ilvL可能单独调控自身转录。这些结果表明溶藻弧菌支链氨基酸合成具有不同于其它细菌的新机制。