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本研究以家蚕品种引6的卵巢为实验材料,旨在了解家蚕卵巢在五龄至蛹期的生理生化变化,通过组织切片观察了卵巢的形态与组织结构变化;利用蛋白质组学、生物信息学和分子生物学的技术方法,检测分析了卵巢中酸性磷酸酶等4种酶活的变化;构建了家蚕卵巢五龄1d和蛹1d的蛋白质表达谱,并进行了蛋白的功能注释和分类;克隆了一个与卵巢发育相关的蛋白的基因并获得表达。主要结果如下: (1)通过组织切片观察了五龄1d至蛹1d卵巢的形态和组织结构变化。家蚕卵巢随发育进行体积逐渐增大,表皮膜变薄;卵巢和卵子也逐渐变大,并且卵子的发育成熟度是有差别的。 (2)测定五龄至化蛹1d卵巢总蛋白含量的变化。在五龄期1~7d的发育过程中,卵巢总蛋白含量持续稳定升高,到吐丝期1d时,总蛋白含量稍稍下降,之后又随着发育的推进呈上升趋势,到蛹期1d时达到13.60μg/μL。通过SDS-PAGE电泳,比较家蚕五龄期1~7d、吐丝期1~2d、蛹期1d的蛋白组分差异,在分子量为78.7kDa、73.5kDa、31.9kDa、29.5kDa的条带有明显差异变化,这些蛋白可能与卵巢的发育有关。 (3)检测了五龄至化蛹1d卵巢中的ACP、AKP、T-SOD和GST的活力变化。在五龄期,ACP活力呈平缓抛物线型,在吐丝期持续下降,化蛹后又迅速回升,与五龄1d活力水平大致相近。AKP活力在五龄期呈现下降趋势,从第一天10.4818U/g下降到第七天熟蚕时的6.8245U/g,而从吐丝开始到化蛹,活力又重新上升。T-SOD活力在吐丝前呈现下降趋势,之后又逐步升高,到蛹期1d时活力为9.2388U/mg。GST、活力变化较大,从五龄1d上升至3d时达到峰值14.2534U/mg,之后保持在10U/mg左右。吐丝期时开始下降,而后随着化蛹的进行活力升高,到蛹期1d时GST活力为8.4341U/mg。 (4)应用shotgun混合蛋白鉴定技术,首次构建了五龄期1d和蛹期1d卵巢的蛋白质表达谱,在五龄期1d卵巢中总共鉴定得到559中蛋白,在蛹期1d卵巢中总共鉴定出579种蛋白。五龄期1d与蛹期1d卵巢相同的蛋白有480种,分别占五龄期1d卵巢蛋白的85.87%,蛹期1d卵巢蛋白的82.90%。五龄期1d卵巢的特异蛋白为79种,占其鉴定蛋白的14.13%,蛹期1d卵巢的特异蛋白为99种,占其鉴定蛋白的17.10%。五龄期1d与蛹期1d卵巢的蛋白,在分子量为15~60kDa、等电点为4~7、8~10的占绝大多数多;分子量差异主要分布在15~30kDa的分子量范围内,而等电点的分布差异并不大,主要在6~7,9~10的范围内有一定的差异。另外,两者都分别有约11%的鉴定蛋白等电点超过10,这些蛋白在双向电泳中很难分离鉴定。 (5)通过GO工具WEGO对鉴定的蛋白从细胞归属、分子功能及生物学过程三个方面进行了详细分类。结果显示五龄期1d和蛹期1d卵巢能分类注释的蛋白分别有494、516种。在细胞归属分类上,位于细胞内的蛋白最多,位于细胞外的蛋白数最少。在分子功能分类中,注释的大部分蛋白具有结合功能和催化活性,具有转录调控活性的蛋白最少。同时,五龄期1d和蛹期1d的注释蛋白中大部分蛋白参与代谢过程和细胞过程。 (6)在蛹1d卵巢特异性蛋白中筛选了一个与卵巢发育相关的候选基因BmIRPBP进行克隆,获得成功,同时进行诱导表达。