背景及目的:胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是一类由未分化或具有多潜能分化能力的梭形细胞或上皮样细胞组成的最常见的消化道间叶源性肿瘤,其中大于80%的肿瘤具有KIT或血小板源性生长因子受体A(Platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRA)基因突变。但越来越多的证据表明KIT/PDGFRA基因突变并不是GIST演进的唯一机制,其它机制也参与GIST细胞的恶性生物学行为的进展。人叉头框蛋白M 1(Forkhead Box M1,FoxM1)是维持细胞增殖、分化、基因稳定性的重要调控基因,在多种肿瘤中高表达,并且与肿瘤分期分级及患者预后相关。但纵观国内外最新研究进展,FoxM1在GIST中的表达情况尚未见报道,其能否调控GIST恶性生物学行为仍不清楚。因而,我们以此为切入点,分析FoxM1在GIST中的表达及其意义,探索其调控GIST细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并探索缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)-1α、HIF-2α调控FoxM1转录表达的分子机制,旨在明确FoxM1能否促进GIST演进,为今后GIST的临床防治提供理论基础和实验数据。方法:针对以上目的,本研究分为以下四部分。1.FoxM1在胃肠道间质瘤中的表达及其与临床病理因素的相关性研究:收集上海长海医院资料完整、临床病理诊断明确的GIST组织标本共83例,所有GIST病例均有石蜡包埋组织。采用苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色观察GIST组织形态学特征;采用免疫组织化学染色检测FoxM1、CD117(KIT蛋白)、DOG1、CD34在GIST中的表达;抽提石蜡组织DNA,基因测序检测GIST中KIT和PDGFRA基因突变情况;统计分析FoxM1表达与83例GISTs临床病理指标间的相关性。2.FoxM1促进胃肠道间质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的作用研究:采用定量PCR和western blot检测FoxM1在常氧和缺氧环境下的表达,构建FoxM1过表达质粒(pcFoxM1)和特异性短发卡RNA质粒(shFoxM1),转染GIST细胞系GIST-T1和GIST 882,观察FoxM1在常氧(21%O2)和缺氧(1%O2)环境下对GIST细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用。检测指标包括:采用CCK-8检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞划痕实验检测细胞迁移能力、Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力,western blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞周期素A-细胞周期素-依赖性激酶-2(CyclinA-cyclin-dependent kinase 2,Cdk2)及金属基质蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)蛋白表达。3.HIF-1α 和 HIF-2α 对 FoxM1 转录表达的调控机制研究:采用western blot检测HIF-1α和HIF-2α在常氧和缺氧环境下GIST细胞中的表达。构建HIF-1α和HIF-2α特异性短发卡RNA质粒(shHIF-1α和shHIF-2α),分别转染GIST细胞系GIST-T1和GIST 882,采用定量PCR、western blot检测HIF-1α和HIF-2α对FoxM1表达的调控作用。采用生物信息学方法确定FoxM1的转录起始位点和启动子区,查找FoxM1启动子区HIF-1α和HIF-2α潜在结合位点——缺氧反应元件(Hypoxiα response element,HRE)。采用染色质免疫共沉淀(Chromαtinimmunoprecipitαtion,ChIP)检测常氧和缺氧环境下HIF-1α和HIF-2α与FoxM1启动子区的结合。根据ChIP实验结果,构建相应的荧光素酶报告基因载体,通过荧光素酶报告基因检测HIF-1α和HIF-2α对FoxM1转录表达的调控作用,明确具体的结合位点。4.HIF-1α和HIF-2α在胃肠道间质瘤中的表达及其与FoxM1表达的相关性和临床病理意义研究:采用免疫组织化学染色检测HIF-1α和HIF-2α在83例GIST组织标本中的表达,统计分析HIF-1α和HIF-2α与FoxM1表达以及与83例GIST临床病理特征间的相关性。构建GIST荷瘤鼠模型,分为HIF-1α抑制组、HIF-2α抑制组、HIF-1α+HIF-2α联合抑制组、PBS对照组,分别喂饲HIF-1α特异性抑制剂PX-478 2HC1、HIF-2α特异性抑制剂PT-2385,PX-478 2HC1+PT-2385(PX+PT)和磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffer saline,PBS);测量肿瘤体积,并采用免疫组织化学染色检测肿瘤中FoxM1和ki-67蛋白表达。结果:1.FoxM1在胃肠道间质瘤中的表达及其与临床病理因素的相关性:83例 GIST 中 CD117、CD34、DOG1 的阳性率分别为 97.59%、67.47%、100%。83例GIST均不同程度表达FoxM1,阳性信号定位于细胞核。根据FoxM1表达强度分为FoxM1高表达组(n=21)和FoxM1低表达组(n=62)。统计分析表明FoxM1蛋白表达与肿瘤最大径、核分裂像计数、ki-67指数、侵袭转移、NIH危险度、WHO分级有明显的统计学意义(All P<0.001)。但FoxM1蛋白表达与患者性别(P=0.2307)、年龄(P=0.4114)、原发部位(P=0.7555)、组织细胞形态(P=0.8835)、KIT/PDGFRA基因突变(P=0.4060)均无明显相关性。2.FoxM1促进胃肠道间质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用:常氧环境下GIST细胞系GIST-T1、GIST 882分别转染pcFoxM1和载体对照pcEGFP,CCK-8检测结果表明pcFoxM1组细胞在细胞接种的第2、3、4天的生长率明显高于pcEGFP对照组(All P<0.05)。GIST-T1细胞中pcFoxM1组、pcEGFP组S期细胞比例分别为49.80±0.34%、32.90±0.94%;GIST 882细胞中pcFoxM1组、pcEGFP组S期细胞比例分别为45.00±2.04%、30.49± 1.76%;pcFoxM1组和pcEGFP组相比具有明显的统计学意义。细胞划痕实验表明GIST-T1、GIST 882细胞中pcFoxM1组的伤口距离分别是pcEGFP对照组的57%、83%,两组相比具有明显的统计学意义(P<0.05)。Transwell小室实验表明,GIST-T1、GIST 882细胞中pcFoxM1组的侵袭细胞数是pcEGFP对照组的2.68倍和2.73倍,两组相比具有明显的统计学意义。western blot检测表明FoxM1促进GIST细胞表达PCNA、Cdk2、MMP2蛋白,而且FoxM1蛋白随着缺氧时间的延长而表达量增加。缺氧环境下GIST细胞系GIST-T1、GIST 882转染shFoxM1和载体对照shCon,CCK-8检测结果表明shFoxM1组细胞在细胞接种的第2、3、4天的生长率明显低于shCon对照组(All P<0.05)。GIST-T1细胞中shFoxM1组、shCon组S期细胞比例分别为31.98±1.0%、48.19±0.65%;GIST 882细胞中shFoxM1组、shCon组S期细胞比例分别为30.05±1.22%、42.05±2.23%。细胞划痕实验表明48小时后,GIST-T1、GIST 882细胞中shFoxM1组的伤口距离分别是shCon对照组的1.20倍、1.27倍,两组相比具有明显的统计学意义(P<0.05)。Transwell小室实验表明72小时后,GIST-T1、GIST 882细胞中shFoxM1组的侵袭细胞数分别是shCon对照组的0.62倍和0.52倍,两组相比具有明显的统计学意义。western blot检测表明缺氧环境下抑制FoxM1表达可以抑制GIST细胞表达PCNA、Cdk2、MMP2蛋白。3.HIF-1α和HIF-2α对FoxM1转录表达的调控机制:western blot检测表明,随着缺氧时间的延长,HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达呈时间依赖式增加;在常氧环境下,HIF-2α和FoxM1均可见稳定的蛋白表达,而HIF-1α仅在缺氧环境下表达。靶向降低缺氧环境下GIST细胞中的HIF-1α和HIF-2α表达后能有效降低FoxM1的表达水平,而且靶向降低常氧环境下GIST细胞中的HIF-2α表达后亦能降低FoxM1的表达水平。生物信息学分析FoxM1转录起始位点上游3000bp范围内存在5处可能的HRE,其核心序列为 5’-RCGTG-3’,分别为定位于-25(HRE1)、-297(HRE2)、-309(HRE3)、-761(HRE4)、-2324(HRE5)碱基处(相对于转录起始位点)。ChIP实验表明在缺氧环境下,HIF-1α能特异性结合到HRE1,而在常氧环境下未见结合片段;HIF-2α在常氧环境下能特异性结合到HRE1、HRE2、HRE3,而在缺氧环境下,HIF-2α除了可以结合到以上三个位点,还能结合到HRE5。荧光素酶报告基因检测表明HRE1定点突变能显著降低HIF-1α所诱导的FoxM1启动子活性;HRE2、HRE3、HRE5定点突变能显著降低HIF-2α所诱导的FoxM1启动子活性。4.HIF-1α和HIF-2α在胃肠道间质瘤中的表达及其与FoxM1表达的相关性和临床病理意义:83例GIST均不同程度表达HIF-1α和HIF-2α蛋白,其阳性信号定位于肿瘤细胞的细胞核和细胞浆。根据HIF-1α核表达强度分为HIF-1α高表达组(n=35)和HIF-1α低表达组(n=48)。统计分析表明HIF-1α蛋白表达与FoxM1蛋白表达(P=0.0341)、肿瘤最大径(P=0.0499)、NIH危险度分级(P=0.0401)和WHO肿瘤分级(P=0.0478)具有统计学意义。根据HIF-2α核表达强度分为HIF-2α高表达组(n=46)和HIF-2α低表达组(n=37)。HIF-2α蛋白表达则与FoxM1蛋白表达(P=0.0065)、核分裂像计数(P=0.0162)、ki-67 指数(P=0.0060)、NIH危险度分级(P=0.0004)和WHO肿瘤分类(P=0.0025)具有统计学意义。HIF-1α和HIF-2α蛋白差异高表达(即只要一种亚型高表达就归为HIF-α高表达组)与FoxM1蛋白表达(P=0.0005)、肿瘤最大径(P=0.0003)、核分裂像计数(P=0.0021)、ki-67 指数(P=0.0019)、NIH 危险度分级(P=0.0001)、WHO 肿瘤分类(P=0.0006)具有明显的统计学意义。HIF-1α和HIF-2α蛋白同时高表达与FoxM1蛋白表达及GIST临床病理因素指标均无明显相关性。荷瘤鼠实验表明,PBS、PX、PT、PX+PT 组肿瘤体积分别为 80.70±32.14 mm3、39.02±5.46 mm3、38.90±3.87 mm3、15.14±9.30mm3;FoxM1 表达率分别为 66.74±15.12%、50.16±10.28%、44.66 ±4.96%、28.50±9.07%;ki-67 指数分别为 79.34± 11.38%、58.22±9.11%、56.86±8.90%、40.50±12.87%;统计分析表明PX+PT组的肿瘤体积、FoxM1蛋白表达、ki-67指数均显著小于其它3组(All P<0.05)。结论:1.FoxM1高表达与GIST增殖和侵袭性生长等临床病理指标密切相关,可作为判断预后的辅助指标。2.FoxM1可通过促进细胞周期进展、上调PCNA、Cdk2、MMP2表达促进GIST细胞增殖、迁移和侵袭。3.FoxM1是缺氧调控蛋白,其启动子区的HRE1是HIF-1α功能性结合位点,而HRE2、HRE3、HRE5是HIF-2α功能性结合位点。4.在常氧环境下,HIF-2α调控FoxM1转录表达;在缺氧环境下,HIF-1α和HIF-2α协同促进FoxM1的转录表达,形成两级调控系统,即“常氧→HIF-2α→FoxM1”和“缺氧→HIF-1α-HIF-2α→FoxM1”。5.GIST组织中FoxM1蛋白表达与HIF-1α和HIF-2α表达正相关,同时抑制HIF-1α和HIF-2α能有效降低FoxM1蛋白表达,抑制GIST肿瘤生长。