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目的:研究发现,预先给予轻微、短时、不至于引起神经元损伤的脑缺血,可以保护神经元,使其能够耐受其后的通常会引起神经元损伤的较严重的脑缺血。这一现象被称为脑缺血耐受(brain ischemic tolerance,BIT),预先给予的轻微、短时的脑缺血称为脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)。阐明脑缺血预处理脑保护作用的发生机制,对临床上研究、开发提高神经元对缺血缺氧耐受性的治疗方法具有重要意义。
近来有研究表明,丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)级联传导途径可能参与了脑缺血性损害和修复机制。MAPK家族是连接细胞膜表面受体与决定性基因表达间的重要调节酶,其作用涉及多层次的细胞调节,对丝裂素、激素、生长因子的生理病理刺激如缺血缺氧等均可作出不同反应,因而调控着细胞的适应、增殖分化、存活和程序性细胞死亡等几乎所有的生理功能和过程。
细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)是MAPK家族的经典转导通路之一。一般认为ERK1/2在促进神经元细胞增殖、分化及抑制细胞凋亡中发挥重要作用,但对脑缺血预处理后ERK通路作用的研究较少,结果亦相互矛盾。有研究发现ERK信号通路的激活参与 CIP诱导的神经保护作用,但有些研究却发现ERK介导了神经元的死亡。
因此,本次实验旨在通过研究在体情况下全脑缺血预处理中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在海马中的表达,探讨ERK1/2通路是否参与CIP诱导的神经保护作用,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和依据。
方法:健康雄性Wistar大鼠160只,体重280-320g,随机分为4组。大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行sham手术或脑缺血处理,具体分组如下:①sham组(n=40):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;②脑缺血预处理(CIP)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉3 min后恢复再灌注;③损伤性缺血(ischemic insult,Ⅱ)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;④脑缺血预处理+损伤性缺血(CIP+Ⅱ)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。以上各组又分为8个时间点,均于再灌注后即刻、15分钟、30分钟、3小时、1天、2天、4天、7天时断头取海马脑组织,每个时间点n=5。
5μm厚的石蜡切片用于以下实验:1硫堇染色进行神经病理学评价;2免疫组化检测海马各区p-ERK1/2的表达。
参照Kato分级方法,于光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级(Histological grade,HG),标准如下:0级,无神经元死亡;1级,散在神经元死亡;2级,成片神经元死亡;3级,几乎全部的神经元死亡。取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段,取平均数为神经元密度(Neuronaldensity,ND)。高倍镜下计数海马各区p-ERK1/2阳性细胞数量。
结果:
1.神经病理学评价
Sham组大鼠海马CA1区,可见锥体神经元排列整齐、致密、共2~3层,细胞形态完整,胞核饱满,核仁清晰。Sham和CIP组的各时间点,海马CA1区均无明显的DND,HG为0~Ⅰ级,7d时ND分别为202.67±6.43和197.33±6.11。Ⅱ组8 min缺血打击后,从4d开始海马CA1区出现明显的DND,7d时HG为Ⅱ~Ⅲ级、ND为22.67±4.16。与sham组相比,HG明显升高(P<0.01),ND显著降低(P<0.01)。CIP+Ⅱ组各时间点海马CA1区无明显DND,7d时HG为0~Ⅰ级,ND为189.33±7.57。与Ⅱ组相比,HG明显降低(P<0.01),ND显著升高(P<0.01)。表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生脑缺血耐受,使其能够抵抗通常会引起明显DND的严重脑缺血。
2.p-ERK1/2在海马各区的表达
2.1 p-ERK1/2在海马CA1区的表达
各组大鼠在各个时间点,海马CA1区锥体神经元内均未见p-ERK1/2阳性标记产物,CA1区起层和辐射层亦无明显变化。
2.2 p-ERK1/2阳性细胞在海马CA3区表达
Sham组各时间点,大鼠海马CA3区锥体神经元均未见 p-ERK1/2阳性表达产物。CIP组各时间点,大鼠海马CA3区可偶见p-ERK1/2阳性细胞,与sham组比较,无明显差异。Ⅱ组大鼠在再灌注后15分钟和30分钟,海马CA3区开始出现大量的呈棕黄色的p-ERK1/2阳性细胞,与sham组的相应时间点比较,p-ERK1/2阳性细胞数显著升高(P<0.01),以再灌注后15分钟最高。自3h后各时间点,p-ERK1/2阳性细胞数量基本恢复到缺血前的水平。CIP+Ⅱ组的大鼠p-ERK1/2阳性细胞的变化趋势与Ⅱ组相似,在缺血再灌注15分钟和30分钟时,p-ERK1/2阳性细胞均有显著的升高,但与Ⅱ组的相应时间点比较,升高得更加明显(P<0.05,P<0.01)。
2.3 p-ERK1/2阳性纤维在海马CA3区的表达
Sham组的各个时间点,大鼠海马CA3区辐射层可见一定量的p-ERK1/2阳性纤维,但该组的各个时间点之间未观察到明显差异。
CIP组,大鼠在缺血再灌注即刻时间点,CA3区起层和辐射层p-ERK1/2阳性纤维颜色均较浅;随再灌注时间的延长,辐射层的阳性纤维进一步增多,至缺血再灌注2d时,表达的纤维组织达到最高峰;此后逐渐减少,但在再灌注7d时,阳性纤维的表达仍高于即刻时间点的水平。
Ⅱ组,大鼠海马CA3区亦有大量p-ERK1/2阳性纤维。在再灌注15分钟、30分钟时,在出现了大量的p-ERK1/2阳性细胞的同时,纤维组织的表达也明显增强;在缺血再灌注3h、1d时,纤维组织的表达仍处于较高的水平;至再灌注2d后时,纤维组织的表达明显减少。
CIP+Ⅱ组,大鼠CA3区在末次缺血再灌后即刻时间点时海马辐射层就有明显的纤维组织表达;再灌注15分钟、30分钟时,随着p-ERK1/2阳性细胞的表达增多,纤维组织的表达亦明显增多;此后,虽然阳性纤维组织的表达逐渐减少,但至末次缺血再灌注后4天时,仍处于较高的水平。
2.4 p-ERK1/2在海马DG区的表达
Sham组各时间点,大鼠海马DG区分子层有少量p-ERK1/2阳性标记物,但颗粒细胞层及门区均未见p-ERK1/2阳性标记物。与sham组的相应时间点比较,CIP组各时间点,大鼠海马DG区分子层及门区p-ERK1/2阳性标记物有所增多,但海马DG区颗粒细胞层未见明显的p-ERK1/2阳性标记物。Ⅱ组大鼠,在致死性缺血后再灌注15分钟时和30分钟时,海马DG区颗粒层的细胞和门区均可见大量的p-ERK1/2阳性标记物,分子层着色亦明显变深;以15分钟表达最多;再灌注3小时后的各时间点,颗粒细胞层无p-ERK1/2阳性细胞,但门区p-ERK1/2阳性标记物的仍然较高。CIP+Ⅱ组各时间点,大鼠海马DG区p-ERK1/2阳性标记物的表达变化趋势与Ⅱ组相似,但缺血再灌注15分钟、30分钟时DG区颗粒层的阳性细胞数量较Ⅱ组相应时间点的表达明显增多(P<0.05),且p-ERK1/2阳性标记产物形态较Ⅱ组规整。
结论:
1.严重的损伤性缺血可以导致大鼠海马CA1区大量锥体神经元发生明显DND,而提前2天的3 min缺血预处理可以保护锥体神经元,使其能够耐受通常会引起明显DND的8min损伤性缺血。
2.CIP后大鼠海马CA1区p-ERK1/2的表达未发生明显变化,提示p-ERK1/2在CIP诱导的脑缺血耐受中可能不发挥作用。
3.脑缺血预处理可使p-ERK1/2在大鼠海马缺血耐受的CA3区和DG区表达明显增多。该变化提示ERK1/2通路可能与CA3区和DG区具有较强的缺血耐受性有关。