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脑血栓形成是最常见的脑血管疾病之一。常常分布在脑血管相对狭窄、弯曲、分叉或动脉粥样硬化斑块的溪谷处。该疾病所引起的脑梗塞治疗效果差、病残率高，因此目前趋向于以预防血栓形成为主。血栓形成的三要素包括：血管壁异常、血液成分改变及血流异常。针对在这些异常因素，只有抗血小板聚集药物-阿司匹林和噻氯匹啶（ticlopidine）对预防脑血栓形成有一定疗效。经大规模临床双盲对比试验证实，其有效率约20～30％。因此如何提高预防脑血栓形成的有效率成为目前的研究热点。 在心瓣膜病合并房颤时使用阻止纤维蛋白形成的抗凝药物（如肝素和华法令），可降低缺血性脑血管病发病率68％～86％。说明抗凝药物预防血栓形成具有显著疗效。然而上述抗凝药物易并发严重的出血副作用，临床使用时需要严格监测出凝血时间，使用不方便，未能推广应用于预防脑血栓形成所致的缺血性脑血管病。 近年来，组织因子（Tissue factor，TF）在促凝中的作用日益受到关注。组织因子是内皮细胞膜上固有的糖蛋白，它与循环中凝血因子Ⅶ相遇，形成TF-Ⅶa复合物，活化凝血因子X，后者促进凝血酶形成，继之纤维蛋白形成，导致血液凝固。研究表明正常基础状态下TF在脑、肺、肾、皮肤及粘膜等重要器官的血管外层细胞大量表达，以在血管破裂时保证重要器官及时止血。血管内内皮细胞和单核细胞，在基础状态下不表达TF，使血液和血管外的TF隔离，从而保证血液流动通畅，维持血液循环功能正常。但在动脉粥样硬化的脑血管分叉或弯曲处，随着局部切应力显著变化，诱导内皮细胞表达TF，触发局部血管内血栓形成，是触发动脉硬化血管内血栓形成的主要始发因素之一。因此抑制切应力诱导的TF表达是提高预防脑血栓形成效果的主要途径之一。 控制人 TF表达的 TF基因位于 1号染色体门 pZI—22人 CDNA全长2．3 kb。其TF基因启动子的3个Spl肥gr刁位点，是切应力诱导启动TF基因转录的特异调节元件，即切应力反应元件（shear stress resPonsiveelement，SSRE人该元件在切应力显著降低、升高或紊流时与切应力诱导产生的转录因子 Egr4和 Sp结合而激活，继之启动 TF基因表达。因此，SSRE与转录因子Egr二和Spl结合是切应力诱导内皮细胞TF基因表达的关键环节之一。可见阻断SSRE激活对于抑制切应力诱导的TF基因表达具有重要意义。 反基因技术所利用的形成三股螺旋的寡核昔酸krghe helix－forming ，TFOL具有特异性碱基识别能力，能够与线状、松弛环状及超螺旋状质粒DNA或染色体DNA结合形成三股螺旋结构，阻止靶DNA与调节蛋白。多聚酶、转录因子、甲基化酶）结合，阻止靶基因转录、复制及表达。TFO是人工操纵特异基因表达的工具，寡核昔酸经过修饰后可直接透过生物膜，迅速分布于核内靶基因组。己用于抗病毒、抗肿瘤等多方面研究。本课题欲设计合成筛选在生理环境中能特异性地内皮细胞TF基因启动子区SSRE结合的TFO与SSRE结合成三链DNA，阻止SSRE与切应力诱导的Egr1和Spl结合，从而阻止SSRE激活，导致TF基因转录不能启动，TF表达因而受到抑制，到达阻断切应力诱导的血栓形成。本实验针对SSRE的3个即l用grd位点的DNA序列，设计合成TFO，采用电泳迁移分析筛选亲和性最高的TFO、进行硫代磷酸酯修饰，通过同位素标记TFO，测定其细胞内的cpm值，确定其透膜性、耐酶性及亚细胞分布，利用兔疫细胞化学和原位杂交方法结合图像分析，以及TF促凝活性测定初步确定 TFO的抑制效果，同时利用 F．actin和 G．actin荧光染色确定切应力作用的可靠性和稳定性。主要结果与结论如下： 1．TF基因启动子区的切应力反应元件门SRE）由3个Sp用grl位点组成，其中第1位点位于（q5～＊、第二位点位于（七8～80X第3 ·XI· 音“位点位于＋56～68卜这些位点的DNA序列符合反基因技术的不典型靶序列要求，即含有喀唆断点的多聚瞟吟靶序列。根据反基因技术的碱基配对规则，针对第 1位点的 DNA序列，我们设计合成了 4条 14碱基寡核昔酸，针对第2位点，设计合成了8条ZI碱基寡核苦酸，针对第3位点，设计合成了 2条 15碱基寡核昔酸。经过凝胶滞留法（EMSA）筛选，每个位点分别筛选出 1条 TFO，即第一位点为 TI 4GTa，第二位点为 TZI GTa，第三位点为T15GTa，可见均为反向GT寡核昔酸。按其亲和力大小排序为：＊1＊W拙：3．6X IO“‘峋＞T14＊W＊d：1刀X 100M）＞T15＊W＊d：1刀丫10’M卜将筛选出的 3条反向 GT寡核昔酸进行硫代磷酸酯修饰，其亲和力较修饰前稍有降低J条硫代反向GT寡核昔酸亲和性排序分别为：Kd：2．3X10”’M（TZIGTa－ps）＞ Kd：3．8X10”’M（T14GTa－ps）＞ Kd：l．5X10”‘M（T15GTa－pS）与修饰前比较，其亲和性分别下降6．3、3．8、0．5（倍人该结果与其它相关研究报告结果类?