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目的:运用基因重组技术克隆、表达、纯化出新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-Co V-2）的核衣壳（Nucleocapsid）蛋白,建立间接Ig G ELISA法检测新冠患者血清中的SARS-Co V-2 Ig G抗体并进行验证,检测不同分型新冠患者的抗体滴度差异,为临床诊治、深入了解致病机制及防控提供依据,制备鼠抗SARS-Co V-2单克隆抗体,为SARS-Co V-2的深入研究提供有力的工具。方法:1、SARS-Co V-2-N蛋白的基因克隆、表达和纯化:根据SARS-Co V-2-N蛋白的基因序列设计引物,应用PCR法扩增SARS-Co V-2-N基因,将SARS-Co V-2-N克隆到p ET28a中构建重组质粒。重组质粒在大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）BL21的感受态细胞中进行转化,重组SARS-Co V-2-N蛋白在E.coli中表达,通过PCR和DNA序列分析确认。大量培养阳性菌后,用亲和层析柱纯化重组SARS-Co V-2-N蛋白。2、ELISA法SARS-Co V-2血清Ig G检测试剂开发:使用重组SARS-Co V-2-N蛋白建立间接Ig G ELISA法检测新冠患者血清中的Ig G抗体,与市面常用的胶体金试剂盒和SARS-Co V-2刺突S1蛋白Ig G抗体ELISA试剂盒进行对比,验证新建立的方法的可靠性。3、不同分型的新冠患者的抗体滴度的检测:使用本研究建立的间接Ig G ELISA法测量疾病严重程度不同的新冠患者Ig G抗体滴度的差异性。4、鼠抗重组SARS-Co V-2-N蛋白单克隆抗体的制备:用纯化后的重组SARS-Co V-2-N蛋白免疫雄性BALB/c小鼠,骨髓瘤细胞sp2/0和免疫鼠的脾脏细胞进行细胞融合,制备分泌N蛋白抗体的杂交瘤细胞,用Westren Blotting实验及间接免疫荧光实验对制备的鼠抗重组SARS-Co V-2-N蛋白单克隆抗体进行反应原性的鉴定。结果:1、本研究成功构建SARS-Co V-2-N重组表达载体,在E.coli中表达并使用Talon?IMAC亲和层析柱纯化出重组SARS-Co V-2-N蛋白。2、建立基于重组SARS-Co V-2-N蛋白的间接Ig G ELISA检测系统检测新冠患者血清Ig G抗体。与SARS-Co V-2刺突S1蛋白Ig G抗体ELISA试剂盒相比,本研究建立的基于重组SARS-Co V-2-N蛋白的间接Ig G ELISA方法的灵敏度为100%,特异性为98.9%,一致性为99.4%;与胶体金试剂盒相比,灵敏度为100%,特异性为96.8%,一致性为98.3%。本研究建立的基于重组SARS-Co V-2-N蛋白的间接Ig G ELISA方法与购买的两种试剂盒对比,对新冠患者的Ig G抗体检测率更高,更为灵敏。除此之外,胶体金试剂盒检测新冠患者的Ig G抗体时使用的血清稀释比例为1:10,SARS-Co V-2刺突S1蛋白Ig G抗体ELISA试剂盒检测新冠患者的Ig G抗体时使用的血清稀释比例为1:100,而本研究建立的基于重组SARS-Co V-2-N蛋白的间接Ig G ELISA方法对新冠患者血清Ig G抗体进行定量检测时使用的血清稀释比例为1:400。3、实现了新冠患者血清Ig G抗体滴度的定量检测,对88名疾病严重程度不同的新冠患者的抗体滴度检测结果显示,新冠患者在早期康复期的抗体滴度在800-102,400之间,重症和危重病例、普通病例、无症状和轻度病例的几何平均滴度分别为51,203、20,912、9590,说明COVID-19患者的疾病严重程度越重,SARS-Co V-2-N Ig G抗体滴度越高。4、使用重组SARS-Co V-2-N蛋白免疫雄性BALB/c小鼠,制备出来的鼠抗重组SARS-Co V-2-N蛋白单克隆抗体,对本研究纯化出的重组SARS-Co V-2-N蛋白具有高特异性、高敏感性。结论:本研究开发了用于检测SARS-Co V-2 Ig G抗体的高灵敏度ELISA系统。该系统能够对新冠患者的针对重组SARS-Co V-2-N蛋白的Ig G抗体滴度进行定量研究,并发现患病程度越严重的新冠患者Ig G抗体滴度越高。另外,本研究制备出的鼠抗重组SARS-Co V-2-N蛋白单克隆抗体用时短,成本低,为SARS-Co V-2的深入研究提供了有力的工具。