糖基转移酶在自然界广泛存在,具有重要的生物学功能,参与生物体寡糖、多糖、糖脂、糖蛋白和各类糖苷的生物合成。糖基转移酶以活化的糖苷如尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）、鸟苷二磷酸甘露糖（GDP-Man）、磷酸胞苷唾液酸（CMP-Sia）等为糖基供体,受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸等,可催化产生a和β两种不同的糖苷键。糖基转移酶遵循“一种酶,一种键”的原则,具有良好的立体选择性和区域选择性,反应效率高,能高效的合成特定糖苷键,在糖链合成中得到广泛应用。分枝硫醇（mycothiol,MSH）是仅在放线菌中发现的低分子硫醇,而在低（G+C）%革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及真核生物中没有发现MSH的存在。与谷胱甘肽功能相同,MSH在细菌抵抗氧化压力和异源物质的脱毒过程中起到重要的作用。分枝杆菌是放线菌中MSH含量最高的一类菌,其MSH代谢过程被广泛研究。MSH-缺失的突变体表现出对氧化压力、烷基试剂、以及一系列抗生素的敏感性,说明MSH在分枝杆菌存活和致病性中起到重要作用,而对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis Erdman的MSH合成途径进行破坏,没有细菌能够存活,说明MSH为Mtuberculosis Erdman生存所必须。另外通过提高细胞内MSH的含量,能有效提高谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum对烷基试剂、草甘膦、肌醇、抗生素、重金属和芳香类化合物的抵抗力。因此MSH生物合成途径是一个开发新型抗菌药物或能提高现行抗生素效能试剂的靶点。MSH的生物合成包括五步酶催化反应,分别由1L-myo-inositol-1-phosphate N-乙酰氨基葡萄糖转移酶MshA、磷酸酶MshA2、乙酰氨基葡萄糖脱乙酰化酶MshB、ATP-依赖连接酶MshC和乙酰基转移酶MshD实现。目前,除了 MshA2尚未被鉴定以外,其它四个酶已有晶体结构的报道。糖基转移酶MshA起始MSH的生物合成,介导将UDP-GlcNAc的 α-GlcNAc单元转移至1L-myo-inositol-1-phosphate（1L-Ins-1-P）上形成 GlcNAc-Ins-3-P。目前,仅有C.glutamicum来源的MshA被克隆表达,而有关MshA的许多生化性质尚未被研究。因此,对MshA以及MSH生物合成中其它相关酶的研究具有重要意义。本论文首先对来源于病原菌C.diphtheriae的mshA基因进行克隆与表达。将mshA基因与pET-22b载体连接转化表达宿主,E.coli BL21（DE3）,构建基因工程菌用于重组酶的诱导表达。经IPTG诱导和Ni-亲和色谱纯化,获得均一的可溶性蛋白,分子量约为50kDa。以UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P为底物并应用HPLC分析对CdMshA进行酶学性质研究发现,CdMshA的最适温度是40 ℃,在20-50℃范围内酶活稳定;最适pH为8.0,在pH 7-10范围内保持80%以上的活性。CdMshA的催化不需要金属离子的参与,而部分金属离子如Mg2+、Ca2+和K+能稍微增强酶的活性。CdMshA具有严格的底物选择性,只能催化UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P间的反应,不能识别其它UDP-糖苷如UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、UDP-GlcA 以及糖基受体受体如 myo-肌醇、1D-myo-1-phosphate（1D-Ins-1-P）、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸等。CdMshA对糖基供体UDP-GlcNAc的米氏常数Km为0.185 ± 0.047 mM,Kcat为5.184 ± 0.442 Min-1,对糖基受体1L-Ins-1-P的Km和Kcat分别为0.485 ± 0.049 mM和6.907 ± 0.347 Min-1。CdMshA对UDP-GlcNAc的Km与文献报道其他来源的MshA相符,而对1L-Ins-1-P的Km是文献报道的其它来源MshA的两倍左右,说明CdMshA对1L-Ins-1-P有较低的亲和性。随后利用Q-柱对CdMshA转糖基产物进行分离纯化,并用质谱和NMR对其结构进行鉴定,其中GlcNAc异头碳位置质子的耦合常数JH1-2为3.6Hz,说明糖苷键构型为a-构型,最终转糖基产物为 GlcNAc-a1,1-D-myo-inositol-3-phosphate,产率为 95%。根据谷氨酸棒状杆菌CgMshA的晶体结构、CdMshA同源模建和多序列比对推测出 D23、M27、N28、K81、Y113、T137 和 R157 等 7 个与 1L-Ins-1-P 结合相关氨基酸位点。这些位点分别突变成丙氨酸并对突变体蛋白纯化,以UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P为底物在最优反应条件进行下进行转糖基反应,结果显示与原始酶相比,N28A、K81A和R157A突变体几乎完全失去了转糖基能力,T137A保留有30%的活性,而D23A、M27A和Y113A突变体酶活性只有稍微降低。K81/R157和N28分别与1L-Ins-1-P的磷酸基和4-OH间形成氢键,这些能使1L-Ins-1-P在CdMshA活性中心中保持适当的定向,并促使1L-Ins-1-P的3-OH与UDP-GlcNAc的焦磷酸基接近。T137也能与1L-Ins-1-P的磷酸基形成氢键,同时与M27和Y113 一起形成一个口袋,它能安置1L-Ins-1-P轴向的2-OH并限制其自由度以促进反应进行。突变实验结果说明N28、K81、R157和T137是CdMshA关键氨基酸位点。目前尚未有MshA2酶的报道,为筛选具有MshA2活性的磷酸酶,本论文根据文献报道,M tuberulosis来源的肌醇单磷酸酶Rv3137可能参与MSH生物合成。我们在C.glutaicum中以Rv3137氨基酸序列为起点进行BLAST,筛选到四个同源序列,GenBank登录号分别为WP_<sub>011013898.1、WP₀03861968.1、WP₀11265625.1 和 WP₀03862394.1,指定为 ImpA、ImpB、ImpC、ImpD,基因大小分别为 783 bp、828 bp、876 bp 和 759 bp,分别编码 28.9、30.2、31.9 和27.3 kDa蛋白。将这些磷酸酶基因经载体连接转化到表达宿主E.coliBL21（DE3）,构建成工程菌用于重组蛋白的表达。经过亲和色谱纯化后,四个蛋白都获得纯度高的蛋白,其中ImpA、ImpB和ImpC含有His-标签,ImpD在以His-标签表达时为包涵体,后改成GST-标签。在Tris-HCl缓冲液以CdMshA转苷产物GlcNAc-Ins-3-P为底物对四个磷酸酶进行活性筛选,发现ImpC酶对GlcNAc-Ins-3-P有很好的水解活性,而ImpA酶对检测底物活性很差,ImpB和GST-ImpD没有水解活性。对ImpA进行底物选择性分析确认ImpA具有果糖1,6-二磷酸酶活性和1D-Ins-1-P肌醇单磷酸酶活性,对1L-Ins-1-P及其衍生物GlcNAc-Ins-3-P活性很差。ImpC具有MshA2酶活性,为首次发现,因此后续实验围绕磷酸酶ImpC展开。进一步对磷酸酶ImpC研究表明,ImpC在酸性条件下没有活性,在pH 7～9的范围内活性较高,最适pH为8.0,在pH大于10时,酶活性显著降低。ImpC在20～50℃催化比较稳定,最适温度在40 ℃,高于55 ℃活性降低明显。Mg2+是ImpC催化所必需的,不加入Mg2+时ImpC反应中没有无机磷酸的产生,在5 mM Mg2+的条件下ImpC具有最大活性,继续增加Mg2+浓度对ImpC活性有一定的抑制,在100 mMMg2+条件下ImpC保持70%的活性。其它二价金属离子在5 mM浓度时能部分替代Mg2+的功能,如Zn2+、Mn2+和Co2+存在时ImpC有80%以上的活性,Ni2+的作用稍差,约有50%的活性,而Ca2+、Cu2+和Fe2+对ImpC的催化几乎没有作用。Li+是ImpC的抑制剂,IC50为2.0 mM,当Li+达到20 mM浓度时ImpC仅有10%的活性,而其它单价金属离子如高浓度的Na+和K+对ImpC活性影响不大。ImpC具有广泛的底物选择性,能水解多种磷酸化合物,包括GlcNAc-Ins-3-P、1L-Ins-1-P、葡萄糖-1-磷酸、1D-Ins-1-P、果糖-1,6-二磷酸、甘油磷酸和对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate,pNPP）,其中 GlcNAc-Ins-3-P、1L-Ins-1-P和葡萄糖-1-磷酸为优势底物。ImpC对1D-Ins-1-P的水解活性为GlcNAc-Ins-3-P的35%,为1L-Ins-1-P的25%,说明ImpC对肌醇单磷酸的构型存在选择性。ImpC对GlcNAc-Ins-3-P的米氏常数Km值为1.29±0.52 mM,Kcat为37.11±4.66 s-1。水解产物正离子模式下有荷质比为406.82的[M+Na]+的离子峰,与GlcNAc-Ins（383.14,[M+Na]+406.13）的分子量相符。通过多序列比对选取了三个位点D62、L96和D117进行定点突变,分别突变为D62N、L96A和D117N,并对突变体蛋白分离纯化。以GlcNAc-Ins-3-P为底物进行反应,结果显示L96A和D117N突变体完全失去了水解活性,说明L96和D117为ImpC关键氨基酸位点。肽连接酶是一类能在特定氨基酸位点形成肽键的酶类,具有底物选择性和位点特异性,是蛋白工程的理想工具。Butelase 1（Btl1）是一种近来从蝶豆Clitoria ternatea中发现的连接酶,它只需要一个非常简单的C-端结构域Asn/Asp-His-Val进行特异识别,且催化效率非常高（1340000M-N-1s-1）,反应条件温和,具有广泛的底物选择性,在连接反应中能接受大部分N-末端的氨基酸（除了 Pro）,且反应结束后酶的识别序列仅有Asn/Asp残留。Butelase1以简单的底物识别信号、高效的反应效率、广泛的底物选择性等优点,被应用于蛋白和多肽的N-端特异性标记、蛋白的环化、环化细菌素的全合成、硫酯蛋白的合成、含D-氨基酸的多肽的大环化等等。Btl1的纯化是通过传统复杂的蛋白纯化方法从植物的新鲜豆荚中提取,每千克材料大约能提取出5 mg的纯化蛋白,极大限制了其在蛋白工程中的应用。因此对Btl1进行异源表达具有重要的研究意义和应用价值。在本研究中,我们成功构建了 Btl1大肠杆菌和毕赤酵母两种表达体系。在大肠杆菌表达体系中,btl1与不同的载体连接构建成表达质粒,包括pET-28b-btli、pET-32 EK/LIC-btl1、pET-41 EK/LIC-btl1 和 pMAL-c5E-bt1 等,并将 pET 系列表达质粒分别转化E.coliBL21（DE3）和E.coli Rosetta2pLysS 表达菌株,pMAL-c5E-btl1转化E.coliBL21（DE3）,经蛋白表达和纯化发现转化pET-28b-btl1的表达菌株中没有重组蛋白表达,pET-32 EK/LIC-btl1和pET-41 EK/LIC-bti1仅在E.coli rosetta2 pLysS表达菌株中有蛋白表达而且表达的蛋白是以包涵体形式,pMAL-c5E-btl1在E.coli BL21（DE3）中能以可溶蛋白形式表达和纯化出来。在Btl1毕赤酵母蛋白表达体系中,我们构建了胞内表达和分泌表达两个表达载体pPICZ-B-btl/和pPICZ-αC-btli,转化Pichia postoris KM71H菌株,经甲醇诱导表达后均获得可溶蛋白。以合成的多肽KALVINHV和GIGGIR为底物对重组蛋白活性进行检测,不幸的是没有检测到目标产物（KALVINGIGGIR）,重组蛋白未检测到催化活性。以上结果说明通过蛋白重组的方法获得的可溶性重组Btl1的折叠构象与其天然构象存在差异。