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背景和目的慢性疼痛的发病率已高达30%且较顽固,不易缓解,严重的影响了人类的生理及心理健康,目前解决慢性疼痛的医学手段尚存在缺陷,因此寻找一种安全有效的治疗方法是医学工作者为之奋斗的目标。转基因细胞镇痛是适应这一时代的产物,近些年来的研究都表明了其在镇痛领域的可行性,而移植细胞成为这一问题的关键。目前髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成为各学科研究的热点,也同样引起了疼痛工作者的极大兴趣,由于其可取至自体骨髓,取材方便,因此不存在目前移植较棘手的组织配型及免疫排斥等问题。另外其具有的定向分化及归巢的生物学特性,致使可以通过不同的方式给药,更具有临床指导意义。慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury, CCI)模型是基础研究中最常用的神经病理性疼痛模型。其造模简单,成功率高,疼痛持续时间长等特点,使其得到大家的推崇。本实验是在CCI模型的基础上,拟检验本实验室前期已经制备成功的可稳定分泌镇痛物质的人前脑啡肽原(PENK)基因修饰骨髓间充质干细胞(hMSC)的镇痛效果。材料和方法1神经病理性痛大鼠鞘内注射人前脑啡肽原基因修饰骨髓间充质干细胞的镇痛效果取鞘内置管成功的健康雄性SD大鼠40只,周龄6～8周,体重160～180g,随机分为4组(n=10),A组为正常对照组；B组、C组和D组采用坐骨神经慢性压迫性损伤法(CCI)建立神经病理性痛模型,于CCI术后3d鞘内给药,A组和B组鞘内注射生理盐水10μl；C组鞘内注射与BrdU共培养72h转染空载体的hMSC细胞(hMSC-pBABE)细胞悬液10μl(2×108～3×108/μl)；D组鞘内注射与BrdU共培养72h的hMSC-PENK细胞悬液10μl(2×108～3×108个/μl)。于术前、术后3、5、7、9、11、14d时测定热痛阈。术后14d痛阈测定后取新鲜脊髓组织,行免疫组化检测脑啡呔表达及细胞存活情况,免疫荧光法及酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测各组大鼠脑啡呔含量,采用RT-PCR法测定PENK mRNA表达,另采用免疫荧光法检测hMSC细胞分化情况。2神经病理性痛大鼠静脉注射人前脑啡肽原基因修饰骨髓间充质干细胞的镇痛效果取按照Bennett法手术制备CCI模型成功的健康雄性SD大鼠40只,周龄6-8周,体重160-180 g,随机分为4组(n=10),A组为对照组；B组、C组和D组行尾静脉置管术,于CCI术后3d静脉注入各组细胞, B组静脉注射生理盐水1ml；C组静脉注射与BrdU共培养72h转染空载体的hMSC细胞(hMSC-pBABE)细胞悬液1ml (2×108～3X 108/ml); D组静脉注射与BrdU共培养72h的hMSC-PENK细胞悬液10μl (2×108～3×108/ml)。于术前、术后3、5、7、9、11、14 d时测定热痛阈。术后14d痛阈测定后取新鲜脊髓组织,行免疫组化检测脑啡呔表达及细胞存活情况,酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测各组大鼠脑啡呔含量。另采用裸鼠致瘤实验检验该细胞系的安全性。3统计分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行分析,实验结果以均数±标准差(X±SD)表示。经正态和方差齐性检验后,组间及组内均数的比较采用重复测量设计方差分析及单因素方差分析(One-Way ANOVA);两两比较采用LSD分析,以P<0.05为差异有显著意义。结果1鞘内给药组,与术前比较,B组、C组、D组术后各时点热痛阈降低(P<0.05)。与A组比较,B组、C组、D组热痛阈降低,B组和C组PENK mRNA表达下调,D组PENK mRNA表达上调(P<0.05)。与B组和C组比较,D组热痛阈升高,PENK mRNA表达上调(P<0.05)。B组和C组各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化及ELISA结果显示均D组脑啡呔表达较B组和C组升高,B组和C组比较无统计学差异。术后14天在大鼠脊髓组织中仍可检测BrdU标记的hMSC细胞。免疫荧光检测鞘内注入hMSC细胞的C组和D组星形胶质细胞及神经元表达上调,部分细胞可分化为神经元及星形胶质细胞。2静脉给药组,与术前比较,B组、C组、D组术后各时点热痛阈降低(P<0.05)。与A组比较,B组、C组、D组热痛阈降低。与B组和C组比较,D组热痛阈升高(P<0.05)。免疫组化及ELISA结果显示均D组脑啡呔表达较B组和C组升高,B组和C组比较无统计学差异。术后3天在大鼠脊髓组织中仍检测到BrdU标记的hMSC细胞。裸鼠致瘤实验表明注入hMSC-PENK细胞系未产生肿瘤。结论1大鼠鞘内注射PENK基因修饰的hMSC可减轻神经病理性痛。2静脉注射PENK基因修饰的hMSC可定向归巢至中枢神经系统,发挥镇痛效果。3该细胞系未发现致瘤致畸性,因此该细胞用于细胞镇痛的载体细胞是安全的,可用于神经病理性疼痛的细胞移植治疗。