人血清白蛋白是临床上具有重要应用的蛋白,但重组人血清白蛋白未能工业化生产,严重限制了它在临床上的供应。本课题开展人血清白蛋白高效表达和相关的毕赤酵母中基因编辑技术的研究具有重要的应用前景。本文首先将密码子优化后的人血清白蛋白基因通过同源重组技术,整合到毕赤酵母基因组的HIS4位点,构建了能表达重组人血清白蛋白的毕赤酵母菌株,初步优化了表达条件后摇瓶发酵产量在0.52 g/L。为能够利用代谢工程技术促进重组人血清白蛋白的工业化生产,进一步开展了建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究,以便后续能有效地对毕赤酵母进行系统改造。本文从质粒构建出发,在比较了五种毕赤酵母ARSs(PARS1,panARS,mitoARS,PpARS2和ScARS)的质粒转化效率、稳定性和拷贝数后,构建了 RNA pol Ⅲ启动子控制下的CRISPR/Cas9系统。这一新系统与以PARS 1为复制子的系统相比,编辑效率提高10倍,高达80%。本文继续将Cas9基因整合到基因组上,发现无论是RNA pol II启动子还是RNA pol Ⅲ启动子,只要使用毕赤酵母本身的启动子来表达sgRNA均能有较高的编辑效率。最终在毕赤酵母中,构建了基因敲除效率在80%以上而且基因整合效率在70%以上的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。总之,本论文构建成功了一个重组表达生产人血清白蛋白的毕赤酵母基因工程菌,并且进一步建立了更高效的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。这一更高效的基因组编辑技术的建立,将大大加快毕赤酵母基因组改造的效率,从而有利于提高包括人血清白蛋白在内的多种重要医用蛋白质的高效和高质量生产。