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狂犬病是一种急性的人兽共患中枢神经系统传染病,主要表现为外周神经炎症和急性脑炎[1]。该病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)感染引起,且一旦发病尚无有效治疗措施,死亡率几乎为100%。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,全球每年至少50万人接受狂犬病病毒暴露后的预防,狂犬病死亡人数约5.5万人[2]。近年来,我国狂犬病疫情居高不下,成为受狂犬病危害最严重的国家之一[3]。因此,研制有效防治狂犬病的药物具有极其重要的意义。目前临床上对于狂犬病三级暴露后的治疗包括接种狂犬病疫苗和注射抗狂犬病病毒免疫球蛋白(WHO,2005)。抗狂犬病病毒免疫球蛋白(rabies immunoglobulin,RIG)包括人抗狂犬病病毒免疫球蛋白(human rabies immunoglobulin,HRIG)和马抗狂犬病病毒免疫球蛋白(equine rabies immunoglobulin,ERIG)。但HRIG价格昂贵,ERIG存在异种蛋白引起过敏反应和潜在病毒感染的风险,且HRIG和ERIG均不易大量制备,因此急需研制其他血清替代品[4,5]。全人源单克隆抗体为狂犬病的预防和治疗提供了新的解决方法,已成为国内外生物制药领域专家的共识。本研究应用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统,构建狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)的真核表达载体r Bacmid-RVG,表达并纯化重组RVG蛋白(recombinant rabies virus glycoprotein,r-RVG),免疫转人Ig M基因小鼠,筛选制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定基础。研究方法1.构建真核重组表达载体r Bacmid-RVG以Gen Bank发表的狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白基因序列为依据,设计特异性引物,提取病毒RNA,反转录为c DNA,扩增RVG基因,将PCR产物和p Fast Bac-GP67B同时经双酶切后回收连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,筛选重组质粒p Fast Bac-GP67B-RVG。将阳性重组质粒p Fast BacGP67B-RVG转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定阳性后抽提重组表达质粒r Bacmid-RVG。2.重组RVG在Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统中的表达及免疫原性鉴定r Bacmid-RVG转染昆虫细胞Sf-9,待细胞出现明显病变后分别收集培养上清和细胞沉淀。细胞沉淀提取DNA,RVG特异性引物PCR扩增分析。Western blot检测重组RVG的表达。His Trap HP亲和柱纯化重组RVG,SDS-PAGE电泳检测。重组RVG蛋白免疫小鼠,同时设置阴性对照组和空白对照组。间接ELISA方法检测小鼠血清抗重组RVG蛋白Ig G抗体效价。3.制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体以重组RVG蛋白作为抗原,采用皮下多点及腹腔注射法免疫转人Ig M基因小鼠,采用杂交瘤技术筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株。4.全人源抗重组RVG单克隆抗体的鉴定采用双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定。研究结果1.重组表达载体r Bacmid-RVG的构建将提取狂犬病病毒CVS-11株的RNA反转录成c DNA,用RVG特异性引物扩增后片段大小在1 500 bp左右。将阳性重组质粒p Fast Bac-GP67B-RVG双酶切后,含有p Fast Bac-GP67B(4 700 bp)和RVG(1 500 bp)两个条带;用M13通用引物对重组表达质粒r Bacmid-RVG进行PCR鉴定,扩增的片段大小为3 900 bp,与预期相符。2.重组RVG蛋白的表达、纯化及免疫原性鉴定重组r Bacmid-RVG通过Roche试剂转染进昆虫细胞Sf-9,Western blot检测显示病毒上清液和细胞沉淀裂解物在58 k Da处均有特异性条带。从病毒感染的Sf-9细胞中提取总DNA,用RVG特异引物扩增产物有1 500 bp左右,表明重组质粒r Bacmid-RVG基因被转染至Sf-9细胞。以His-Trap HP亲和层析柱纯化重组RVG蛋白在58 k Da处有一条特异性条带,说明蛋白纯度较高。免疫小鼠检测小鼠血清抗体效价,其中150μg/只/次小鼠血清抗重组RVG蛋白的抗体效价为1:25 600,说明重组RVG蛋白具有较好的免疫原性。间接免疫荧光结果显示重组RVG免疫小鼠产生的抗体能与狂犬病病毒Flury株特异性结合。3.筛选全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体重组RVG蛋白免疫转人Ig M基因小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,挑选阳性杂交瘤细胞株经过三次亚克隆后共获得5株稳定分泌全人源抗重组RVG蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D1、9A3、15D6、19E6、6H11。4.全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体的鉴定双抗体夹心ELISA结果显示5株单抗均为人源性免疫球蛋白Ig M类型的抗体。间接ELISA实验结果表明5株单抗均能特异性结合重组RVG蛋白,3株6H11、15D6、9A3可以与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合。研究结论1.构建了重组表达载体r Bacmid-RVG,成功用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫原性,为制备全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体提供了有效抗原。2.建立了5株稳定分泌全人源抗重组RVG蛋白Ig M单抗的杂交瘤细胞株,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合。为一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础。