目的本研究结合国际阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)研究日趋重在防治的主流研究趋势,结合衰老、表观遗传修饰与AD病理发生发展的高度相关性,以中缝背核GSK3β/m TOR信号通路介导的神经原纤维缠结的形成和自噬清除过程为切入点,旨在探讨预针刺对D-半乳糖诱导的AD样病理模型大鼠认知功能的影响,初步阐明预针刺防治AD样病理大鼠认知损伤的效应及表观遗传学作用机制,以期为促进、推广针灸“治未病”防治AD提供科学的实验依据。方法3月龄Sprague Dawley雄性大鼠72只,随机分为正常组、模型组、预电针+抑制剂组、抑制剂组、预针刺组、预电针组,每组12只。各组大鼠在相同的环境下饲养,除正常组外,其余各组予D-半乳糖(120mg/kg/天)连续腹腔注射7周。预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组大鼠自造模第一日起予针刺百会、肾俞干预。百会穴向前平刺3-5mm,肾俞穴向脊柱方向斜刺3-5mm,接上HANS-200A型电针治疗仪,一对导线分别接百会和肾俞穴,左右侧肾俞隔日交替使用。电针频率50Hz,电流1m A,以穴位局部颤动为佳,留针20min,每日1次,共治疗7周。预针刺组不接电针仪。另外,预电针+抑制剂组、抑制剂组在造模的第7周,加予DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine处理(腹腔注射给药,0.4mg/kg/天)。正常组、模型组在其他组干预时进行相同的抓取捆绑固定。各组大鼠干预结束后进行开放旷场实验、Morris水迷宫实验等行为学检测。行为学实验结束后进行新鲜海马、中缝背核组织取材和灌注取材并进行指标检测。应用透射电镜观察海马CA1区神经元微管情况、突触后致密带厚度和突触间隙宽度;应用高尔基染色法观察海马CA1区树突棘密度;应用Western-Blot法检测中缝背核GSK3β、GSK3β-p Tyr216、GSK3β-p Ser9、m TOR、m TOR-p S2448、LC3I/LC3II、Tau-5、Taup S262、PHF-1、DNMT1的蛋白表达水平,海马Tau-5、Tau-p S262、PHF-1的蛋白表达水平;应用免疫组化法检测中缝背核PHF-1的表达及定位,应用免疫荧光检测中缝背核DNMT1、GSK3β的表达及定位;应用RT-PCR法检测中缝背核GSK3βm RNA表达水平;应用重亚硫酸盐测序法检测中缝背核GSK3β基因启动子区Cp G岛的甲基化水平。结果1.预电针和预针刺均能够改善D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠的认知损伤,且预电针的保护效应强于预针刺(1)旷场实验结果:模型组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间较之正常组均明显下降(P<0.01),与模型组相比,DNMT1抑制剂可加重此抑郁样行为(P<0.01),而预电针+DNMT1抑制剂组、预电针组大鼠的抑郁样行为却得到明显缓解(P<0.01)。另外,预电针组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间均显著高于预电针+DNMT1抑制剂组(P<0.01)。同时,预针刺组大鼠的运动距离、直立次数和中央区域停留时间高于模型组(P<0.01)但均低于预电针组(P<0.05;P<0.01),说明预电针防治D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠抑郁情绪的效应强于预针刺。(2)Morris水迷宫实验结果:与正常组相比,模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.01),抑制剂组的逃避潜伏期较之模型组显著延长(P<0.01),其他干预组预电针+抑制剂组、预针刺组和预电针组的逃避潜伏期较之模型组均显著减短(P<0.01)。同时,预电针组大鼠的逃避潜伏期较预针刺组短(P<0.01)。空间探索实验中,与正常组相比,模型组在目标象限探索时间显著降低(P<0.01)。干预结束后,与模型组相比,预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组大鼠在目标象限中的探索时间均延长(P<0.01),且其运动轨迹亦主要集中分布在目标平台周围,而抑制剂组大鼠在目标象限中的探索时间较模型组显著降低(P<0.01)。预电针干预较预针刺干预的保护效应更佳。2.预电针、预针刺均能够改善D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠海马CA1区的突触损伤和神经元微管损伤,且预电针的保护效应强于预针刺(1)树突棘高尔基染色结果:与正常组相比,其余大鼠海马CA1区树突棘密度显著降低(P<0.01);与模型组相比,抑制剂组的树突棘密度显著降低(P<0.01),而预电针+抑制剂组大鼠海马CA1区的树突棘密度与模型组之间无统计学差异变化。同时,预针刺组和预电针组均能升高AD样大鼠海马CA1区的树突棘密度(P<0.05,P<0.01),且预电针组大鼠的树突棘密度较预针刺要高(P<0.01)。(2)突触后致密带厚度和突触间隙结果:各组大鼠海马CA1区的突触间隙宽度均无统计学差异变化。而在影响突触后致密带厚度方面,与正常组相比,模型组大鼠海马CA1区的突触后致密带厚度显著减小(P<0.01),抑制剂组的突触后致密带厚度较模型组显著降低(P<0.01)。与模型组相比,预针刺、预电针干预能够提高突触后致密带厚度(P<0.01),且预电针+抑制剂能逆转抑制剂的突触损伤效应,提高突触后致密带厚度(P<0.01)。但是,预针刺组和预电针组大鼠海马CA1区的突触后致密带厚度变化差异无统计学意义。(3)神经元微管结果:正常组大鼠海马CA1区神经元轴突内微管排列紧密、致密,成交叉致密网状结构,微管无异常断裂现象。模型组大鼠CA1区神经元轴突内微管稀疏,以断裂形式散在分布,可见自噬体存在。抑制剂组大鼠神经元轴突内微管固缩,微管排列杂乱无章,呈云絮样分布,线粒体固缩变性,可见自噬体。预电针+抑制剂组大鼠神经元轴突内微管分布稀疏,但较抑制剂组、模型组致密、微管长度较长,无云絮样分布。预针刺组和预电针组大鼠CA1区神经元轴突内微管致密、排列均匀,无明显异常断裂现象,可见自噬体分布。3.预电针、预针刺均能抑制AD样病理大鼠中缝背核GSK3β/m TOR信号通路和NFTs的沉积,但预电针仅在抑制tau蛋白磷酸化效应上强于预针刺(1)中缝背核NFTs免疫组化结果:与正常组相比,模型组大鼠NFTs水平升高(P<0.01)。与模型组比较,预针刺组、预电针组大鼠NFTs水平均降低(P<0.01)。抑制剂组和模型组比较,NFTs水平显著升高(P<0.01),而预电针+抑制剂组大鼠NFTs水平较之模型组显著下降(P<0.01)。另外,预针刺组和预电针组大鼠NFTs水平差异无统计学意义。(2)中缝背核、海马tau蛋白磷酸化水平结果:与正常组比较,模型组大鼠海马、中缝背核tau-5,PHF-1和tau-p S262相对表达量显著升高(P<0.01)。较之模型组,预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组tau-5,PHF-1和tau-p S262相对表达量显著降低(P<0.01)但仍高于正常组(P<0.01),而抑制剂组tau-5,PHF-1和tau-p S262相对表达量与模型组之间差异无统计学意义且仍高于正常组(P<0.01)。另外,预电针较预针刺更能显著抑制tau蛋白异常过度磷酸化(P<0.05或P<0.01)。(3)中缝背核GSK3β/m TOR通路相关蛋白结果:与正常组比较,模型组GSK3β、GSK3β活性位点GSK3β-p Tyr216相对表达量显著升高(P<0.01),GSK3β抑制位点GSK3β-p Ser9相对表达量显著降低(P<0.01)。较之模型组,预针刺组、预电针组大鼠中缝背核区GSK3β、GSK3β-p Tyr216的相对表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)但仍高于正常组,GSK3β-p Ser9相对表达量显著升高(P<0.01)但仍低于正常组。抑制剂组大鼠GSK3β、GSK3β-p Tyr216的相对表达量较之模型组差异无统计学意义,但GSK3β-p Ser9的相对表达量却显著降低(P<0.01)。同时,与模型组比较,预电针+抑制剂干预能显著下调中缝背核区GSK3β、GSK3β-p Tyr216水平(P<0.01)但仍高于正常组,而GSK3β-p Ser9的相对表达量差异却无统计学差异。另外,预针刺和预电针抑制GSK3β活性的作用大小无统计学差异。与正常组相比,模型组中缝背核区m TOR,m TOR活性位点m TORp S2448相对表达量显著升高(P<0.01),LC3I/LC3II比值显著升高(P<0.01)。较之模型组,预针刺组、预电针组大鼠m TOR、m TORp S2448相对表达量显著降低(P<0.01),LC3I/LC3II比值显著降低(P<0.01)。另外,较之预电针组,预针刺组m TOR、m TOR-p S2448相对表达量升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,抑制剂组大鼠m TOR、m TOR-p S2448相对表达量差异无统计学意义,但预电针+抑制剂组干预能够上调m TOR、m TOR-p S2448相对表达量(P<0.01或P<0.05)。4.预电针、预针刺均能够降低AD样病理大鼠中缝背核GSK3β基因启动子区Cp G岛的甲基化水平并抑制GSK3β基因的转录及表达,但预电针仅在抑制GSK3β基因转录的效应上强于预针刺(1)中缝背核DNMT1 WB结果:与正常组相比,模型组大鼠中缝背核DNA甲基转移酶DNMT1相对表达量显著降低(P<0.01)。较之模型组,DNMT1抑制剂组DNMT1相对表达量显著降低(P<0.05),预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组大鼠中缝背核区DNMT1相对表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)但仍低于正常组(P<0.01或P<0.05)。另外,预电针对DNMT1抑制剂的阻断效应要强于预针刺(P<0.05)。(2)中缝背核DNMT1免疫荧光结果:与正常组相比,模型组大鼠DNMT1阳性细胞率显著降低(P<0.01)。与模型组相比较,抑制剂组DNMT1阳性细胞率显著降低(P<0.05),而预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组DNMT1阳性细胞率显著升高(P<0.01)但仍低于正常组(P<0.01),且预电针对DNMT1抑制剂的阻断效应要强于预针刺(P<0.05)。(3)中缝背核GSK3β基因启动子区Cp G岛的甲基化水平结果:与正常组相比,模型组大鼠GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化水平显著下降(P<0.01)。与模型组比较,抑制剂组大鼠GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化水平显著下降(P<0.05),而预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组大鼠GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化水平显著升高(P<0.05或P<0.01),但仍低于正常组水平(P<0.01)。预针刺和预电针组大鼠GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化水平差异无统计学差异。另外,通过对GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化位点比较分析发现,位点118、215、284、26、57、221、205等位点为针刺效应靶点。(4)中缝背核GSK3βRT-PCR结果:与正常组相比,模型组大鼠GSK3βm RNA相对表达量显著升高(P<0.01),说明D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠中缝背核区GSK3β基因转录水平升高。与模型组比较,抑制剂组大鼠GSK3βm RNA相对表达量显著升高(P<0.05),而预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组GSK3βm RNA相对表达量显著降低(P<0.01),但仍高于正常组水平(P<0.01),且预电针较预针刺干预更能显著降低GSK3βm RNA相对表达量(P<0.01)。(5)中缝背核GSK3β免疫荧光结果:与正常组相比,模型组大鼠GSK3β阳性细胞率显著升高(P<0.01)。与模型组相比较,抑制剂组GSK3β阳性细胞率无统计学差异,而预电针+抑制剂组、预针刺组、预电针组GSK3β阳性细胞率显著降低(P<0.05或P<0.01)但仍高于正常组(P<0.01或P<0.05)。预针刺组和预电针组间中缝背核区GSK3β阳性细胞率差异无统计学意义。结论:1.预电针和预针刺均能够改善D-半乳糖诱导的AD样病理模型鼠的抑郁情绪和空间学习记忆能力,且预电针的保护效应较之预针刺佳。通过抑制NFTs沉积、减轻神经元微管损伤和突触功能障碍可能是预电针、预针刺防治AD样病理模型鼠认知损伤的重要机制之一。2.预电针和预针刺均能够通过抑制D-半乳糖诱导的AD样病理模型鼠中缝背核GSK3β/m TOR通路,从NFTs的生成和自噬清除两方面途径抑制中缝背核NFTs的沉积,且预电针较预针刺抑制tau蛋白过度磷酸化的效应强,但在促进NFTs自噬清除的效应上无差异。3.预电针和预针刺均能够上调D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠中缝背核区GSK3β基因启动子区Cp G岛甲基化水平,抑制GSK3β基因的转录和表达,从而抑制GSK3β/m TOR通路,进而抑制NFTs的生成和促进其自噬清除。但预电针仅在抑制GSK3β基因转录的效应上强于预针刺,提示其他表观遗传修饰机制可能参与预电针对GSK3β基因转录的抑制作用。