本研究首先通过升主动脉缩窄手术(TAC)构建C57B/L6小鼠的压力超负荷心肌肥厚模型,发现在压力超负荷介导的心肌肥厚、心力衰竭的发生发展过程中存在LRP6以及p-LRP6水平的动态变化,其中p-LRP6在TAC术后3天,1周,2周明显上调,但在TAC术后4周明显下调。接下来对体外培养的新生大鼠心肌细胞分别给予机械牵张和血管紧张素Ⅱ刺激,发现随着刺激持续时间的不同,LRP6以及p-LRP6的水平也呈现动态变化,且p-LRP6的水平亦呈现先升高后降低的趋势。此外,在TAC术后小鼠的心脏侧群细胞(CSPs)中以及培养的新生大鼠CSPs机械牵张后也检测到了p-LRP6水平的上调。为了进一步说明LRP6参与了压力超负荷介导的心肌肥厚、心力衰竭,我们包装了shLRP6慢病毒和LRP6过表达慢病毒,分别感染新生大鼠心肌细胞并给予机械牵张刺激。发现LRP6干扰后,机械牵张所激活的心肌细胞MAPK信号、机械牵张所引起的ANP等肥厚基因表达上调以及心肌细胞表面积增大的效应被进一步增强；而LRP6过表达后则部分抑制了机械牵张激活的MAPK信号。此外,我们还发现shLRP6慢病毒干扰心肌细胞LRP6表达后,明显上调了ATl受体的蛋白表达水平。免疫共沉淀结果提示在正常情况下心肌细胞上LRP6与AT1受体之间存在结合,而机械牵张会导致两者结合减少。为了在体内进一步证实LRP6在压力超负荷介导的心力衰竭发生、发展过程中的作用,我们培育了Tamoxifen诱导的Cre介导的心肌特异性LRP6敲除的小鼠。结果发现’Tamoxifen诱导成年小鼠心肌特异性敲除LRP6后,小鼠迅速出现了严重的心力衰竭及死亡,心肌收缩力明显减弱,组织学观察心脏明显扩大,心重体重比升高,电镜检测观察到有线粒体自噬现象的发生,线粒体膜电位下降、线粒体功能受损。综合以上研究结果,我们认为LRP6在心力衰竭的发生、发展过程中发挥了重要的作用,压力超负荷介导的LRP6下调可能是从代偿性心肌肥厚向心力衰竭转变的关键因素之一。第一部分 LRP6在压力超负荷介导的心力衰竭发生发展过程中的表达变化目的：观察LRP6的表达是否在压力超负荷介导的心力衰竭发生、发展过程中发生变化。方法：8-10周龄野生型C57B/L6小鼠行升主动脉缩窄手术(TAC)构建心肌肥厚模型,分为假手术组、TAC3天组、TAC1周组、TAC2周组以及TAC4周组。取材前行心脏超声以及血流动力学检查评估造模成功情况。提取心脏组织蛋白,检测LRP6、p-LRP6表达情况。体外培养新生大鼠心肌细胞,分别给予机械牵张以及血管紧张素Ⅱ刺激不同时间,提取心肌细胞蛋白检测(?)LRP6、p-LRP6表达情况。流式细胞仪分选假手术组以及TAC术后小鼠心脏侧群细胞(CSPs),提取蛋白,行微量蛋白电泳(NIA)检测p-LRP6水平。培养新生大鼠心脏侧群细胞,机械牵张后行细胞免疫荧光染色以及提取蛋白行微量蛋白电泳检测p-LRP6水平。结果：小鼠压力超负荷模型构建成功。TAC术后心脏组织LRP6水平上调,p-LRP6在术后3天显著上调,但当心肌肥厚进入失代偿期即TAC术后4周时,p-LRP6水平下调。新生大鼠心肌细胞机械牵张6小时后LRP6水平升高,牵张10分钟时p-LRP6水平即升高,牵张1小时左右达较高水平,后有所降低。使用Wnt3a分泌的抑制剂IWP2对机械牵张引起的p-LRP6升高无明显影响。新生大鼠心肌细胞给予血管紧张素Ⅱ刺激6小时后LRP6水平升高,血管紧张素Ⅱ加入5分钟时p-LRP6即明显升高,6小时左右有所降低,使用IWP2对血管紧张素Ⅱ刺激引起的p-LRP6升高影响亦不明显。由于LRP6与干细胞的增殖、分化关系密切,我们观察了心脏侧群细胞的情况。发现压力超负荷模型引起了心脏侧群细胞的增殖,TAC术后小鼠心脏侧群细胞中p-LRP6水平升高。培养的新生大鼠心脏侧群细胞机械牵张后p-LRP6水平亦升高。结论：在压力超负荷模型中,LRP6、p-LRP6的表达发生明显变化,提示LRP6可能是参与压力超负荷介导的心肌肥厚、心力衰竭的因素之一。第二部分 LRP6参与压力超负荷介导的心肌肥厚机制的初步研究目的：研究LRP6在压力超负荷介导的心肌肥厚中发挥的作用。方法：包装shLRP6慢病毒,感染新生大鼠心肌细胞以干扰LRP6表达。LRP6干扰后给予机械牵张刺激8分钟,提取细胞蛋白,检测MAPK信号通路成员p-ERK、 p-P38、p-JNK的表达水平。机械牵张不同时间点,提取细胞总RNA,行Real-Time PCR检测胎儿型基因ANP、BNP、SAA的表达情况。机械牵张24小时用a-MHC抗体行免疫荧光染色,测量心肌细胞表面积。包装LRP6过表达慢病毒,使大鼠乳鼠心肌细胞过表达LRP6,机械牵张8分钟、30分钟检测p-ERK、p-P38、p-JNK表达水平。检测心肌细胞LRP6干扰后AT1蛋白表达水平以及mRNA表达水平。免疫共沉淀检测新生大鼠心肌细胞中LRP6与AT1受体的相互作用。结果：新生大鼠心肌细胞LRP6干扰后机械牵张8分钟,p-ERK、p-P38、p-JNK较对照病毒牵张组显著上调。心肌细胞LRP6干扰后机械牵张,ANP、BNP、SAA的表达较对照病毒牵张组升高,心肌细胞表面积较对照病毒牵张组增加。心肌细胞过表达LRP6后机械牵张,在8分钟时间点,p-ERK水平较对照病毒牵张组下调；在30分钟时间点,p-P38、p-JN K水平较对照病毒牵张组下调。大鼠乳鼠心肌细胞干扰LRP6后,AT1蛋白表达水平较对照组上调,而mRNA表达却略有下降。免疫共沉淀结果显示：LRP6与AT1受体存在结合,机械牵张后两者结合减少。结论：新生大鼠心肌细胞LRP6干扰后进一步促进了机械牵张介导的心肌肥厚,这一作用可能与AT1受体的蛋白表达量增加有一定关系。LRP6对AT1受体蛋白表达量的调节可能发生在转录后水平上。LRP6与AT1受体之间存在结合,机械牵张引起两者结合减少。测心肌细胞LRP6干扰后AT1蛋白表达水平以及mRNA表达水平。免疫共沉淀检测新生大鼠心肌细胞中LRP6与AT1受体的相互作用。第三部分 Tamoxifen诱导的心肌特异性LRP6敲除小鼠出现心力衰竭表型及机制的初步研究目的：在体研究LRP6在成体心脏中的作用。方法：培育Pamoxifen诱导的Cre介导的心肌特异性LRP6敲除小鼠。在小鼠8周龄时给予Tamoxifen腹腔注射连续3天(O.1mg/g/d),使小鼠心肌特异性敲除LRP6。行心脏超声、血流动力学检查,包埋石蜡切片行HE染色,留取标本行电镜检查,以观察小鼠心肌特异性敲除LRP6后的心脏表型变化。提取心脏组织线粒体检测线粒体功能,提取心脏组织总蛋白、线粒体蛋白、胞浆蛋白行Western Blot检测以初步探索相关机制。结果：心肌特异性敲除LRP6的小鼠迅速出现了严重的心力衰竭表现：左心室壁变薄、心腔扩大、EF值明显下降,死亡率明显升高。电镜检测观察到有线粒体自噬现象的发生,部分区域结构破坏严重,出现大量空泡并伴有大量脂滴聚集。线粒体膜电位下降,线粒体功能受损。与线粒体fission相关的p-DRP1(ser616)水平明显升高,且DRP1向线粒体转位,胞浆β-Catenin水平未见明显下降。结论：Tamoxifen诱导小鼠心肌特异性LRP6敲除后出现了严重心力衰竭的表现,这可能与线粒体功能受损有一定的关系,而且可能与Wnt/β-Catenin信号通路无关。