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薏米是我国最古老的作物之一,作为一种传统的健康食品,薏米营养价值很高,被誉为“禾本科植物之王”,其活性成分的研究一直是相关领域的研究热点。本研究先采用80%丙酮提取薏米粉末制得薏米多酚粗提物,再用正丁醇萃取得到正丁醇相提取物,正丁醇相提取物经葡聚糖LH-20凝胶柱进一步纯化制得薏米多酚亚组分纯化物,最后用半制备液相纯化得到4种酚类化合物后,采用HPLC-DAD-ESI-MS,1H NMR,和13C NMR技术分析薏米多酚的结构;以福林-酚法测定各组分总酚含量,以氧自由基吸收能力(ORAC)、清除过氧化氢自由基能力法(PSC)和细胞抗氧化实验(CAA)三种方法测定薏米多酚各级分的抗氧化活性;以MTT法测定薏米多酚各级分的抗肿瘤活性;进一步采用倒置显微镜观察技术结合Western bot实验,探讨薏米多酚对肿瘤细胞凋亡的影响。1、薏米多酚的分离纯化、结构鉴定采用80%丙酮溶液提取薏米粉末制得薏米多酚粗提物,再用正丁醇将粗提物萃取得到正丁醇相提取物,正丁醇相提取物经葡聚糖LH-20凝胶柱进一步纯化制得薏米多酚亚组分纯化物,最后亚组分纯化物经半制备液相纯化得到4种酚类化合物。采用HPLC-DAD-ESI-MS,1H NMR,和13C NMR分析薏米多酚纯品的结构;采用HPLC-DAD测定薏米多酚粗提物、萃取物及亚组分中多种酚类化合物的含量。结果表明:薏米多酚粗提物、正丁醇相、水相、亚组分一和亚组分二中含量最多的酚类化合物均为N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺(含量分别为:12.33±0.53mg/g,16.01±0.81mg/g,4.41±0.02mg/g,2.02±0.03mg/g和106.41±3.43mg/g),亚组分三中含量最多的酚类化合物为阿魏酸(含量为62.90±2.12mg/g)。四种酚类化合物经鉴定,分别为:N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺(1)、对香豆酸(2)、阿魏酸(3)、芦丁(4)。2、薏米提取物各组分的总酚含量及抗氧化活性采用福林-酚法测定各组分总酚含量,以抗氧化能力指数(ORAC)、清除氧化氢自由基能力法(PSC)和细胞抗氧化试验(CAA)三种方法测定提取物各级分和多酚纯品的抗氧化活性。实验结果表明:在薏米多酚粗提物、正丁醇相提取物和水相提取物中,正丁醇相提取物总酚含量最高(43.84±2.94mg GAE/g),抗氧化能力最强(ORAC值:717.65±33.88μmol TE/g,PSC值:185.59±15.92μmol TE/g,CAA值:41.38±0.55μmol QE/g);在亚组分中,亚组分三总酚含量最高(183.42±3.27 mg GAE/g),抗氧化能力最强(ORAC值:2500.76±65.10μmol TE/g,PSC值:1454.45±72.55μmol TE/g,CAA值:153.57±8.51μmol QE/g);在多酚纯品中,对香豆酸ORAC值最高(6975.22±210.36μmol TE/g),阿魏酸PSC值最高(2367.95±111.21μmol TE/g),芦丁CAA值最高(1143.88±80.98μmol QE/g)。3、薏米提取物各组分抗肿瘤活性采用MTT比色法分析薏米提取物各级分及多酚纯品对人体HepG-2肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞及CaCo-2结肠癌细胞的体外抗增殖活性。结果表明,在肿瘤细胞可生长的浓度范围内,薏米多酚粗提物、正丁醇相提取物、亚组分二、亚组分三、N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺、对香豆酸和阿魏酸对三种细胞均有一定的抗增殖作用,且抑制效果与处理浓度呈现正相关的关系,其中HepG-2肝癌细胞对薏米提取物及多酚纯品的作用最为敏感,CaCo-2结肠癌细胞敏感性最弱。在所有薏米提取物及多酚纯品中,N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺的抗增殖活性最强,IC50值分别为:46.34±3.99μg/mL(HepG-2),61.52±6.02μg/mL(MCF-7),92.69±5.63μg/mL(CaCo-2)。4、N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺对HepG-2细胞凋亡的影响以不同浓度的N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺处理HepG-2细胞48h,采用倒置微镜观察细胞形态,发现经处理的细胞出现了严重的变形并伴随着数目的减少,细胞变圆,边缘变得模糊,表明N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺在体外可显著改变HepG-2细胞形态引起细胞凋亡。采用Western bot实验分析N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺处理对细胞内cytochrome c,caspase-9,caspase-3,Bcl-2和Bax蛋白表达的影响,结果显示N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺处理可上调cytochrome c,caspase-9,caspase-3和Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达,且各蛋白表达量对样品浓度均呈现明显的量效依赖关系,表明N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺是通过参与线粒体介导的细胞凋亡实现对HepG-2细胞的抑制。