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L-苹果酸(L-malic acid,L-羟基丁二酸)是一种重要的天然有机酸,在医药、食品、建材和化工等领域具有非常广泛的用途。本文以可再生资源葡萄糖为原料,替代目前工业生产L-苹果酸广泛采用的微生物转化工艺中使用的化石原料顺丁烯二酸酐,利用特定微生物的胞内酶系,生物合成为L-苹果酸或其聚合物,旨在规避化石原料的不可再生和不可持续特点,降本增效、节能减排。首先,优化了出芽短梗霉BK-10发酵生产聚苹果酸的培养基组分和摇瓶培养条件。结果表明,葡萄糖 100 g/L、尿素 1.5 g/L、KH2PO40.2 g/L、ZnSO40.2 g/L、MgSO4 0.05 g/L、KC1 0.75 g/L、CaCO3 30 g/L为最适培养基配方,最适装液量为20%、接种量为10%;在此基础上添加0.01%(W/V)的Tween 80可使聚苹果酸产量提升17.04%。在最适发酵温度26℃培养5 d,酸解后测得苹果酸产量达到79.23 g/L,糖酸转化率达到0.71 g/g,较优化前提高了 48.7%。上述最适培养基配方和培养条件在5L发酵罐上进行了验证,结果表明,优化后的糖酸转化率较优化前提高了 18.33%,发酵周期亦有所缩短,生产强度提高了 52.39%。其次,前期研究表明,出芽短梗霉发酵产生聚苹果酸的过程中,约有10%的葡萄糖被用于普鲁兰多糖的合成,因此本文通过设计同源片段对普鲁兰多糖合成途径中的普鲁兰合成酶基因进行敲除,以求达到减少普鲁兰多糖的合成、增加聚苹果酸产量的目的。但实验结果证明,普鲁兰多糖合成途径位于糖酵解途径的起始位置,对出芽短梗霉至关重要,普鲁兰合成酶基因的敲除影响了菌体对葡萄糖的利用,使得菌体无法正常生长和代谢,更出现了不再产生聚苹果酸,并且其他杂酸如乳酸、乙酸、富马酸等增多的状况。此外,本文还对可以发酵葡萄糖生产L-苹果酸的米曲霉进行了分子改造。通过梳理和分析米曲霉中的L-苹果酸生物合成途径,挖掘出三个关键酶——苹果酸转运蛋白(C4T318)、丙酮酸羧化酶(pyc)、苹果酸脱氢酶(mdh)。通过拼接构建表达载体,在米曲霉中实现了这三个基因的过表达,结果表明,过表达苹果酸转运蛋白编码基因能明显提高L-苹果酸的产量,相比野生菌提高了 2倍多。