背景:近年来,全基因组测序技术的不断发展使人类能够在分子水平上对微生物有一个更加深入的认识。研究发现,许多次级代谢产物生物合成基因大都聚集排列成簇存在,这些基因簇的转录表达不仅受到全局性调控蛋白的影响,还与途径特异性调控因子和染色质介导的调控有关。染色质介导的调控通过表观遗传对组蛋白进行修饰如甲基化、组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化等改变染色质的构象,促进或抑制一些DNA与转录因子的结合,来实现激活或沉默一些基因簇的表达。近年来,以组蛋白去乙酰化酶为靶点进行微生物育种越来越受到研究者的欢迎,对组蛋白去乙酰化酶基因进行分子遗传操作或通过化学小分子抑制剂作用于去乙酰化酶,来改变组蛋白乙酰化和去乙酰化动态平衡,这样不仅可以让真菌次生代谢行为发生明显变化,提高多种已知代谢产物生物合成基因表达,还能激活沉默基因簇,产生新的化合物。丝状真菌橘青霉(Penicillium citrinum)作为一种重要的药用微生物,其代谢产物美伐他汀和橘霉素在人们生活中发挥着重要作用。美伐他汀是降血脂药物普伐他汀的前体,具有较好的药用开发价值。本实验室对橘青霉全基因组进行了测序并初步分析结果发现:橘青霉基因组中存在54个次级代谢产物生物合成基因簇,其中聚酮类化合物(PKS)14个,非核糖体多肽类(NRPS)17个,萜类(Terpenes)8个,其它类11个,目前报道的只有美伐他汀生物合成基因簇。组蛋白去乙酰化酶序列scRpd3、scHda1以及sc Sir2是当前人们对去乙酰化酶分类的主要参考序列,均来自于酿酒酵母,通过本地blast分析,我们发现橘青霉中与之同源的蛋白序列分别是Pci-Rpd3为57.9%、Pci-Hda1为54.9%以及Pci-Sir2为50%。这些组蛋白去乙酰化酶是否参与橘青霉次级代谢和生长发育具有重要研究意义。目的:结合化学小分子抑制剂丁酸钠(SB)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)和分子遗传学手段对橘青霉组蛋白进行表观遗传修饰,靶向改变表观遗传酶类的表达,探究组蛋白去乙酰化酶基因rpd3对橘青霉美伐他汀产量生物合成和生长发育的影响,为研究丝状真菌次级代谢产物的表观遗传调控奠定理论基础。方法:1.采用96孔板稀释法检测小分子抑制剂SB和SAHA的最低抑菌浓度,然后设置浓度梯度在PGA培养基中进行发酵培养,第八天后对发酵液进行处理,通过HPLC进行检测,观察美伐他汀产量的变化。2.选择化学小分子抑制剂的一个最适浓度,检测在小分子抑制剂作用下橘青霉菌落形态、菌丝发育及菌体干重的变化,通过RT-q PCR检测橘青霉无性生殖相关基因aba A和brl A和美伐他汀生物合成相关基因mlc B和mlc R转录水平的变化。3.对橘青霉全基因组测序,通过本地blast、NCBI等软件分析橘青霉组蛋白去乙酰化酶,采用RT-qPCR检测并比较小分子抑制剂作用下橘青霉组蛋白去乙酰化酶基因转录水平的差异。4.克隆组蛋白去乙酰化酶基因rpd3全长,通过酶切、纯化和连接等分子操作构建pGiHTGi-rpd3重组载体。然后将重组载体转入农杆菌(Agrobacterium)LBA4404中,通过农杆菌介导的真菌转化体系构建OE::rpd3菌株,并经抗性平板和PCR进行阳性转化子筛选。5.在PGA培养基中对橘青霉野生型和OE::rpd3菌株进行发酵培养,第8天后对发酵液萃取处理进行HPLC检测,观察美伐他汀产量的变化;与野生型对比观察菌落形态、菌丝生长、孢子产量的变化。利用RT-qPCR检测橘青霉无性生殖和美伐他汀生物合成相关基因转录水平,从而探究组蛋白去乙酰化酶基因rpd3对橘青霉次级代谢产物和生长发育的影响。结果:1.通过96孔板稀释法测得SB作用下橘青霉MIC值为50 mM,当SB浓度≤0.05 m M,美伐他汀的产量与空白组相比无明显变化;当SB浓度≥25 m M时,美伐他汀的产量急剧下降;其中在1 mM SB作用下,美伐他汀产量最大为61.485±1.735 mg/L,空白组产量为55.437±1.233 mg/L,较空白组增加了10.91%。2.SAHA作用下橘青霉MIC值为250μM,当SAHA浓度﹤0.005μM时,美伐他汀的产量趋于平稳,与空白组无明显差别;当SAHA浓度﹥1.00μM时,美伐他汀产量迅速下降;当SAHA浓度为0.01μM时,美伐他汀产量达到最大60.692±1.579 mg/L,空白组产量为51.496±1.07 mg/L,较空白组增加了19.74%。3.RT-qPCR检测,与空白组相比,在1 mM SB作用下,美伐他汀生物合成相关基因mlc R,mlc B的相对表达量上调约为190%和140%;与无性生殖相关的基因aba A,brlA表达量上调约为127%和101%;当SAHA浓度为0.01μM时,美伐他汀生物合成相关基因mlc R,mlc B的表达量是对照组的3.61倍和4.09倍;无性生殖相关基因aba A,brlA的表达量约为对照组的1.66倍和2.25倍。1 mM SB和0.01μM SAHA作用橘青霉,组蛋白去乙酰化酶基因rpd3、hda1转录水平受到抑制且对rpd3的转录抑制效果较为明显,其相对表达量分别为0.732±0.089和0.231±0.004,与空白组相比明显下调了,但sir2的转录水平则变化不大。4.成功构建pGiHTGi-rpd3重组载体,通过农杆菌介导的真菌转化转入橘青霉并筛选得到rpd3过表达菌株OE::rpd3。5.通过在PGA培养基中发酵,与野生型对比rpd3过表达株美伐他汀产量大幅下降,约为野生型的1/2;生长发育与野生型对比,OE::rpd3菌株生长发育明显滞后;RT-q PCR检测后,与野生型相比,OE::rpd3菌株美伐他汀生物合成途径转录因子mlcR在48 h和72 h的相对表达量分别下调10.33%和65.46%;美伐他汀生物合成基因mlc B在36 h、48 h和72 h的相对表达量分别下调65.75%、48.16%和49.31%。无性生殖相关基因abaA在36 h、48 h和72 h的相对表达量分别下调54.91%、94.75%和23.48%;brl A在36 h、48 h和72 h的相对表达量分别下调88.93%、74.54%和5.92%。橘青霉OE::rpd3菌株全局性调控因子Lae A的转录也受到一定的抑制作用,在48 h和72 h的相对表达量约为野生型的1/2和1/3。结论:化学小分子抑制剂在一定的浓度范围内能够影响橘青霉主要次级代谢产物美伐他汀的生物合成和无性生殖,并表现出促进的作用。在1 mM SB作用下,美伐他汀产量较野生型增加10.91%;当SAHA浓度为0.01μM时,美伐他汀产量提高了19.74%。将橘青霉组蛋白去乙酰化酶基因rpd3过表达后,美伐他汀产量大幅下降,产量约为野生型的1/2,其生长发育出现明显的滞后。橘青霉组蛋白去乙酰化酶基因rpd3对美伐他汀生物合成和生长发育起到一个负调控的作用,我们推测在橘青霉染色质介导调控次级代谢产物及生长发育过程中,对组蛋白进行去乙酰化修饰,导致染色质构象发生变化,一些全局性调控基因的转录水平受到一定程度的激活或抑制如全局性调控因子Lae A,直接或间接影响机体代谢和生长发育。