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目的:通过本研究拟了解: 1.慢性HCV感染患者与慢性HBV病毒感染患者、正常对照间认知功能的差异,明确慢性HCV感染患者认知功能损害的程度和模式;以及与慢性HBV感染患者比较,认知功能损害是否为慢性HCV感染患者的独特特征。2.慢性HCV感染患者的认知功能与抑郁症状的关系。3.设计并建立巢式荧光定量PCR(Nested-qRT-PCR)检测慢性丙型病毒感染患者CSF中HCV 5’NCR基因片段,进一步证实慢性HCV感染患者的CSF中是否存在HCV感染。4.初步探讨HCV对CNS的直接感染是否与慢性HCV感染患者认知功能的损害有关。方法:1、采用目前较为常用的神经心理测验工具对36例轻度慢性HCV感染患者、32例慢性HBV病毒感染患者及28例对照者进行测验,各组还采用Beck抑郁自评量表(BDI-II)进行抑郁症状的评定。2、根据GenBank提供的基因序列,针对HCV基因的保守区域(HCV 5’NCR基因),设计并合成特异性内外引物和荧光标记TaqMan探针。从重庆医科大学病毒性肝炎研究所惠赠的含有目的基因的质粒出发,利用PCR方法扩增获得目的基因,克隆至pGEM-T Easy载体进行体外转录,将得到的RNA纯化并使用RiboGreen方法进行定量后作为阳性标准品。分别建立正链和负链HCV RNA的巢式荧光定量RT-PCR方法并分析敏感性和特异性。3、应用Nested-qRT-PCR方法检测12例慢性丙型肝炎病毒感染患者外周血液单个核细胞和脑脊液HCV 5’NCR基因片段,并对脑脊液阳性样本进行分子克隆和测序分析。同时对这12例患者进行神经心理测验,比较脑脊液HCV阳性者与阴性者的测验成绩。结果:1、HCV感染患者在反映注意、记忆和言语功能的测验如数字符号、延迟逻辑记忆、言语流畅性测试重复数、连线B测验(TMT-B)和Stroop测验上与健康对照组有差异,尤其在数字符号、TMT-B和Stroop-cw测验上差异显著,而HBV患者与健康对照组各项测验值均无差异。2、本研究成功建立了正链和负链HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法,其最低检出限即敏感性分别为2.6×102copies/μl、2.6×101 copies/μl,标准曲线的定量范围分别为2.6×102～2.6×107copies/μl、2.6×101～2.6×107copies/μl,相关系数R2分别为0.9883和0.9969,不与其他病毒发生非特异反应。3、共对12例慢性丙型肝炎感染患者的PBMCs,脑脊液细胞中的正链和负链HCV RNA (positive-和negative- strands)进行了检测,10例PBMCs检测5’NCR基因片段为阳性,而其中3例CSF正链HCV RNA检测阳性(3/12),2例负链HCV RNA检测阳性(2/12)。4、12例慢性丙型肝炎病毒感染患者中脑脊液HCV检测阳性者(3例)与脑脊液HCV检测阴性者(9例)以及健康对照组的神经心理测验成绩比较,脑脊液HCV阳性者在数字符号和TMT-B测验上与脑脊液HCV阴性者以及正常对照组有统计学上的差异。结论:1、慢性HCV患者在需要持续注意和更复杂的注意力集中测试的视觉扫描,以及知觉运动速度,工作记忆上存在障碍,此认知功能损害与抑郁自评症状之间无显著相关性。在HBV感染患者中没有发现类似的认知损害,提示这种认知功能损害模式是慢性HCV患者所独特的。2、本研究构建了HCV 5’NCR基因核酸定量检测用的正链和负链RNA标准品,并建立了正链和负链HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有灵敏性和特异性高、简便快捷等有点,不易出现污染引起假阳性结果,适用于脑脊液等体液细胞相对较少、RNA浓度过低的定量检测。3、部分慢性HCV感染患者脑脊液中存在有HCV感染,HCV对CNS的直接感染可能与慢性HCV患者的认知功能损害有关。