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背景心肌肥厚是对各种外源性或内源性刺激的一种代偿性反应,这种反应早期可以通过代偿增强心肌收缩力来维持正常的心功能。但若刺激因素持续存在,这种代偿性反应将会转变成失代偿,出现心室壁增厚、心室腔扩大、心功能恶化,而导致心力衰竭、心源性猝死等一系列心血管不良事件的发生。心肌肥厚是许多心血管疾病如高血压病、心肌梗死、心脏瓣膜狭窄等疾病的共同的病理过程。研究发现,在心肌肥厚的发生发展过程中,多种因素参与其中,包括神经内分泌系统的激活、胚胎基因的异常表达、信号传导通路的改变等。然而,目前心肌肥厚的发病机制仍不十分明确,因此,阐明心肌肥厚的发生机制将为心肌肥厚和心力衰竭的防治提供新的靶点。Tisp40(transcript induced in spermiogenesis40)是一种Ⅱ型跨膜蛋白。又名雄激素诱导蛋白(androgen-induced bZIP, AIbZIP)、Creb314(cAMP responsive element binding protein3-like4)。首先发现其在前列腺癌细胞中表达上调。它是CREB(cAMP反应器结合蛋白)/ATF(激活转录因子)家族中重要的一员。CREB/ATF家族均含有碱性亮氨酸拉链(basic region-leucine zipper, bZIP)结构,该结构在介导蛋白和蛋白以及蛋白和DNA结合过程中起着非常重要的作用。Tisp40大部分位于内质网膜上。当受到外界刺激时,Tisp40被高尔基体SIP (Site1protease)剪切转移至细胞核中调节下游的靶基因。Tisp40广泛表达于机体的各种组织中,具有多种生物学功能。目前研究发现Tisp40参与内质网应激反应、细胞凋亡、信号转导、能量代谢等,并与生殖、癌症的发生发展密切相关。然而,Tisp40在心肌肥厚中的作用及其信号调控途径,尚缺乏深入的研究。本课题旨在通过主动脉缩窄术(Aortic Banding, AB)建立小鼠心肌肥厚模型,应用Tisp40基因敲除及心脏特异性高表达转基因小鼠观察Tisp40对心肌肥厚的作用,并进一步阐述其分子生物学机制。方法实验一：选取8-10周龄,体重23.5-27.5g,雄性野生型C57BL/6小鼠(WT)为实验对象,通过胸主动脉缩窄的方法构建压力超负荷诱导的心肌肥厚模型。随机分为7组,分别是假手术对照组(sham)、胸主动脉缩窄术(AB)后1天组、3天组、1周组、2周组、4周组与8周组。实验二：选取8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性野生型Tisp40基因敲除(Knockout, KO)小鼠、心脏特异性Tisp40转基因(Transgenic, TG)小鼠和野生型C57BL/6(WT)对照小鼠作为实验对象,通过主动脉缩窄术构建心肌肥厚模型,随机将小鼠分为假手术对照组(shamn)和胸主动脉缩窄术(AB)模型组,即：Tisp40KO sham组、Tisp40KO AB组、Tisp40TG sham组、Tisp40TG AB组、WT sham組WT AB组。KO组和TG组分别在实验结束时,通过超声心动图及血流动力学检查对心功能进行评价；比较各组小鼠心脏重量／体重(HW/BW)、肺脏重量/体重(LW/BW)及心脏重量/胫骨长(HW/TL)的比值；通过大体标本拍照、心肌组织H&E染色、WGA染色与PSR染色观察形态学变化；采用实时定量RT-PCR技术检测心肌肥厚和纤维化的分子标志物mRNA水平。实验三：选取8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性野生型Tisp40基因敲除(Knockout, KO)小鼠、心脏特异性Tisp40转基因(Transgenic, TG)小鼠和野生型C57BL/6(WT)对照小鼠作为实验对象,通过主动脉缩窄术构建心肌肥厚模型,随机将小鼠分为sham对照组和AB模型组。术后4周及8周,通过Western blot法测定各组小鼠心肌组织中MAPKs、内质网应激等心肌肥厚相关的重要信号通路分子的磷酸化及总蛋白的表达。结果Western blot检测结果显示,小鼠心肌组织的Tisp40蛋白表达在胸主动脉缩窄术后3天出现明显上调,观察至术后8周一直维持在较高的表达水平(P<0.05vssham)。免疫荧光结果显示,Tisp40蛋白在AB术后转移至细胞核。AB术后4周,超声心动图及血流动力学检查结果显示,与野生型小鼠相比,Tisp40基因敲除小鼠心功能显著恶化,表现为左室室壁厚度增厚、心室腔变大、左室收缩与舒张功能明显降低(P<0.05)；病理形态学结果显示,Tisp40基因敲除的小鼠HW/BW, LW/BW, HW/TL、心肌细胞横截面积和左室胶原容积百分比较野生型小鼠均显著增高(P<0.05)；RT-PCR结果显示,Tisp40基因敲除小鼠心肌组织中的ANP、BNP以及(3-MHC等心肌肥厚标志物和CTGF、collagen la、 collagen Ⅲα与TGF-β等纤维化标志物的mRNA表达水平均高于野生型小鼠(P<0.05),a-MHC和SERCA2a等反映收缩功能的标志物nRNA表达水平则降低(P<0.05)。心脏特异性Tisp40转基因小鼠在AB术后8周,其心肌肥厚和心脏纤维化的程度均较野生型明显改善(P<0.05)AB术后4周,运用western blot检测方法,检测各组小鼠心肌组织MAPKs,内质网应激反应等与心肌肥厚相关的重要信号通路基因的磷酸化与总蛋白水平,发现Tisp40基因敲除能够进一步增加压力超负荷所诱导的MAPKs,内质网应激相关信号通路的激活(P<0.05),而心脏特异性Tisp40转基因在AB后术8周,可以抑制压力超负荷所激活的内质网应激反应以及MAPKs信号通路(P<0.05)结论1.通过胸主动脉缩窄术构建的心肌肥厚动物模型中,Tisp40在心肌细胞核蛋白的表达水平显著上调。2.Tisp40基因敲除可加重压力超负荷所诱导的心肌肥厚与心肌纤维化；而心脏组织特异性过表达Tisp40能够减轻压力超负荷诱导的心肌肥厚与心肌纤维化。3.Tisp40通过抑制内质网应激反应及MAPKs等信号通路的激活来抑制压力超负荷所诱导的小鼠心肌肥厚与心肌纤维化。