1前言：　　乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升的趋势，乳腺癌已经成为当前社会的重大公共卫生问题[1-4]。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命，但是由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间的连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随着血液和淋巴液播散全身，形成转移，危机生命[5-9]。随着生活水平的提高，人们对于自己的生活质量的追求不断提升，对乳腺癌的治疗不仅希望保证生命安全，也对自身的形象有更高的要求。因此寻找和鉴定乳腺癌的特异性分子标记物，对于早期诊断和治疗乳腺癌至关重要。　　TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族的名称是由于其具有三个保守的结构域而得来的[10，11]。TRIM蛋白家族由100多个成员组成，其中人类基因组已经发现和鉴定出70个TRIM蛋白成员[10-12]。TRIM家族蛋白在生物体生长发育过程中有两项最主要的生物学功能:其一是通过干扰病毒的复制过程而发挥其抗病毒的功能[13-15];其二是发挥模式识别受体的功能，识别病毒的衣壳蛋白，调控生物体的天然免疫系统[16-19]。近年来多项研究表明TRIM蛋白家族成员参与调控细胞的增殖、分化、发育、凋亡以及肿瘤的发生和发展过程[20-25]。大量研究表明，TRIM家族蛋白与各种肿瘤的发生发展密切相关。TRIM24在肝癌[26]、乳腺癌[27]、前列腺癌[27]等肿瘤中的表达发生异常，即可发挥促癌基因的作用，也可发挥抑癌基因的作用。TRIM28在直肠癌组织中过量表达，并且与患者的不良预后情况显著相关，发挥重要的原癌基因功能。TRIM28在肠癌中过表达水平与低表达的p53显著相关，且TRIM28高表达与患者总生存期和无进展生存期的缩短密切相关[28]。TRIM27在人宫颈癌细胞中过表达，使得肿瘤细胞对化疗药物顺铂产生抵抗性[29]。在卵巢癌患者组织中同样检测到了TRIM27的过表达现象，并且其过表达水平与化疗耐药性呈正相关[30]。最近有研究发现TRIM59在多种肿瘤中表达升高，但其临床意义和具体作用机制尚不明确。　　本研究旨在探讨TRIM59蛋白在乳腺癌组织中的表达情况及临床意义。另外，我们还研究了TRIM59对乳腺癌细胞增殖、侵袭、细胞周期、凋亡等生物学行为产生的影响及其分子机制。　　2、材料与方法：　　2.1、组织样本　　乳腺癌组织以及相应癌旁正常组织取自于在中国医科大学附属第一医院诊断为乳腺癌并接受手术切除治疗的患者。本研究经过中国医科大学附属第一医院伦理学会的批准。　　2.2、细胞培养　　MCF-10A, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF7, ZR-75-1以及SK-BR-3细胞系购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。培养细胞所用培养基为RPMI-1640培养基，其中包含10％胎牛血清，100 ug/ml的链霉素以及100U/ml青霉素。培养条件为37℃，5％CO2。　　2.3、细胞转染与干扰　　转染所用质粒pCMV6-TRIM59以及空载质粒购买于美国的Origene公司，转染试剂Attractene transfection reagent购买于德国Qiagen公司。干扰所用SMARTpool siRNATRIM59以及阴性对照Non-targeting siRNA购买于美国Dharmacon公司。干扰试剂Dharmafectl reagent购买于美国Dharmacon公司。　　2.4、免疫组织化学　　肿瘤组织首先经过包埋，并制备4μm厚度的样片。本实验过程所用一抗为trim59，使用稀释比例为1∶200。过氧化物酶反应用DAB plus试剂盒，复染使用苏木精染色液，封片前用浓度梯度酒精进行脱水。两位病理专家对所有样本进行随机检测，每个样本随机选取5个视野，每个视野在放大400倍条件下均可观察到100个细胞。　　2.5、 Western blot　　本实验所用抗体有TRIM59、cyclin E/A/B、p-AKT、AKT、bcl-2、bcl-xl、 p53、 p21、p27(cell signaling technology)、GAPDH(Santa Cruz，USA)，辣根过氧化物酶耦合的二抗(Abcam，USA)。RIPA细胞裂解液中包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。蛋白定量使用BCA蛋白定量试剂盒。　　2.6、 RNA提取以及RT-PCR　　样本总RNA的提取使用Trizol试剂。实时荧光定量PCR实验使用SYBR Greenmaster mix试剂盒。PCR实验所用仪器为7500 Real-Time PCR System。内参基因使用β-actin。目的基因的扩增倍数的测算方法依据2-△△Ct。本实验重复3次。　　2.7、细胞增殖实验　　MTT实验:细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为每孔5×103个细胞，连续培养5天。每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液，并继续在37℃条件下培养4小时。将培养基去除，每孔加入150μl DMSO。用酶标仪进行检测，检测波长为490nm。集落形成实验:细胞接种于直径为6 cm的细胞培养皿，接种密度约为1000个/皿。细胞连续培养2周，用PBS缓冲液漂洗细胞表面，并用吉萨姆染色液进行染色。在光学显微镜下进行观察，超过50个细胞的集落即可进行计数。　　2.8、细胞转移和侵袭实验　　细胞侵袭实验用24孔Transwell小室。将稀释后的细胞悬液加入到transwell上室中，下室加入含15％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃条件下培养16小时。将未闯过基质胶的细胞用棉签轻轻擦去，将穿过基质胶的细胞用4％多聚甲醛进行固定，用苏木精进行染色。随机选取5个视野并在显微镜下进行计数。　　2.9、流式细胞术　　收集经过转染及干扰的细胞，并用PBS缓冲液漂洗细胞。用250μl的缓冲液将细胞进行重悬，并用1％多聚甲醛进行固定。固定后加入5 mg/ml碘化丙啶或者5 mg/ml碘化丙啶及AnnexinⅤ/FITC。黑暗条件下染色15分钟后将细胞应用于流式细胞仪，分别分析细胞的周期和凋亡水平。　　2.10、统计分析　　数据统计分析所用软件为SPSS16.0。分析trim59的表达模式与临床病理因素之间的关系采用卡方检验法。其他处理组与对照组之间所得数据采用Students t检验方法进行分析。P＜0.05表示两组之间存在显著差异。　　3、结果：　　3.1、 TRIM59在乳腺癌组织中表达升高　　我们通过免疫组化的方法检测了95例乳腺癌组织和15例正常乳腺组织中TRIM59蛋白的表达情况。TRIM59主要在细胞浆和细胞膜上表达。参考文献报道[31]，我们根据其染色强度和染色范围，将染色分为4个等级。0分:0/0（强度/范围）;1分:弱浆染色和/或≤25％浆染色;2分:中等强度浆染色和/或≤50％浆染色;3分:强浆染色和/或≥50％浆染色。其中0分和1分为低表达，2分和3分为高表达。95例乳腺癌组织中，TRIM59高表达比率为44.1％(42/95)。在15例正常乳腺上皮中TRIM59表达为阴性或弱表达。以上结果说明，TRIM59在乳腺癌组织中高表达。　　3.2、 TRIM59在乳腺癌中的临床意义　　TRIM59在乳腺癌组织中显著上调与肿瘤较高的TNM分期(p=0.0056)以及淋巴结转移(p=0.0088)密切相关。但与患者的年龄(p=0.5226)，肿瘤的大小(p=0.6160)无显著相关性。此外，TRIM59的高表达与乳腺癌患者雌激素受体缺失(p=0.0197)和和孕激素受体缺失(p=0.0215)显著相关。TRIM59在三阴性乳腺癌组织中的表达水平明显高于非三阴性乳腺癌组织(p=0.0157)。采用Kaplan-Meier统计方法分析TRIM59表达水平与乳腺癌患者生存时间之间的关系。结果表明TRIM59表达量较高的患者生存时间低于TRIM59表达量较低的患者。　　3.3、 TRIM59在乳腺癌细胞中的表达以及TRIM59转染与干扰　　通过Western blot检测TRIM59在正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF-7, ZR-75-1,SK-BR-3)中的内源表达水平。结果显示，在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中，TRIM59表达缺失。乳腺癌细胞系中，MDA-MB-453、BT474以及SK-BR-3细胞中TRIM59的表达水平较高，而BT594、MCF-7以及T47D细胞中TRIM59的表达水平较低。分别选择内源表达量较低的MCF-7细胞和内源表达量较高的SK-BR-3细胞进行TRIM59的转染和干扰实验，并通过western blot方法分析转染以及干扰效率。结果显示转染TRIM59后，MCF-7细胞中TRIM59的蛋白表达量显著提高;而敲除TRIM59基因后，SK-BR-3细胞中TRIM59的蛋白表达量则明显降低。　　3.4、 TRIM59促进乳腺癌细胞增殖　　将转染以及干扰TRIM59的乳腺癌细胞分别应用于MTT实验和集落形成实验。MTT结果显示: TRIM59过表达后，MCF-7细胞的增殖率提高;而敲除TRIM59后，SK-BR-3细胞的增殖率降低。集落形成实验结果显示，TRIM59过表达后，MCF-7细胞形成的集落数目增加（155±8.5 VS328±24）;而敲除TRIM59后，SK-BR-3细胞形成的集落数目减少（250±16.2 VS120±12.1）。　　3.5、 TRIM59促进乳腺癌细胞的侵袭　　我们将经过TRIM59转染以及干扰的乳腺癌细胞系应用于划痕实验和基质胶侵袭实验以分析TRIM59对乳腺癌细胞转移和侵袭能力发挥的作用。划痕实验结果表明:MCF-7细胞中，TRIM59过表达使得乳腺癌细胞48小时的迁移距离较对照组明显增加（62.6±3.1 VS93.6±4.2）;而在SK-BR-3细胞中，TRIM59表达缺失则导致乳腺癌细胞48小时的迁移距离较对照组减少（112.3±3.7 VS81±5.2）。基质胶侵袭实验表明TRIM59能够促进乳腺癌细胞侵袭。在MCF-7细胞中，TRIM59过表达使得乳腺癌细胞穿膜数目增加（41.6±V5.5S75.3±4.5）;而在SK-BR-3细胞中，TRIM59表达缺失则导致乳腺癌细胞穿膜数目减少（97.6±6.1 VS52.6±5.8）。　　3.6、 TRIM59促进乳腺癌细胞进展　　通过流式细胞术分析经过TRIM59转染以及siRNA TRIM59干扰该基因的乳腺癌细胞的周期变化。实验结果显示，TRIM59过表达后，MCF-7细胞的S期所占比例升高（（S:22.6±1.2 VS31±1.1），G2期所占比例降低;（G2:39.2±0.9 VS30.6±1.4）。而在SK-BR-3细胞中，TRIM59表达缺失使得细胞S期所占比例降低(S:6.1±0.5 VS3.1±0.3)，G2期所占比例升高（G2:8.2±0.6 VS10.7±0.7）。　　3.7、 TRIM59增强乳腺癌细胞的化疗耐药性　　将经过TRIM59转染以及干扰的细胞用顺铂进行干预，诱导肿瘤细胞发生凋亡，并通过流式细胞术分析细胞的凋亡水平变化。结果显示:TRIM59过表达后，由顺铂诱导的细胞凋亡率较对照组明显降低（21.2±1.3VS12.7±1.1）;而在SK-BR-3细胞中，TRIM59表达缺失后由顺铂诱导的细胞凋亡率较对照组明显升高（10.8±0.9 VS17.6±1.3）。　　3.8、 TRIM59调控乳腺癌细胞中周期和凋亡相关蛋白　　通过western blot方法检测分析了细胞中与周期、凋亡相关指标的表达水平变化。结果显示TRIM59过表达可上调乳腺癌细胞MCF-7中cyclinA，cyclinB，cyclinE，bcl-xl，bcl-2的表达水平，同时下调p21，p27的表达水平。而在敲除TRIM59基因后，SK-BR-3细胞中cyclinA，cyclinB，cyclinE，bcl-xl，bcl-2的表达量下调，同时p21，p27的表达量上调。　　3.9、 TRIM59抑制caspase的剪切和cytochrome c的释放　　通过western blot方法检测细胞中与细胞程序性凋亡相关指标的表达水平变化。实验结果表明，TRIM59过表达后，MCF-7细胞中cleaved-caspase3，cleaved-caspase9，cleaved-caspase PARP的表达量均显著降低;而在SK-BR-3细胞中敲除TRIM59基因后，cleaved-caspase3，cleaved-caspase9，cleaved-caspase PARP的表达量显著上调。此外，在TRIM59高表达的MCF-7细胞中还检测到了cytochrome c的表达量较对照组下调，而在SK-BR-3细胞中，TRIM59表达缺失则导致cytochrome c表达量上调。　　3.10、 TRIM59下调乳腺癌细胞中p53水平并上调p-AKT水平　　检测了细胞中多条信号通路的变化水平，发现TRIM59过表达可激活AKT信号通路，上调p-AKT的表达量;而使用siRNA敲除TRIM59基因后，SK-BR-3细胞中p-AKT的表达量的表达量下调。此外，TRIM59过表达可下调MCF-7细胞中p53的表达量，而TRIM59表达缺失则上调细胞中p53的表达量。　　3.11、 TRIM59促进乳腺癌细胞中p53的泛素化过程　　免疫共沉淀实验结果表明乳腺癌细胞中TRIM59过表达可促进p53的泛素化过程。　　4、结论：　　乳腺癌组织中TRIM59过表达并与肿瘤较高的TNM分期以及淋巴结转移密切相关。TRIM59的高表达与乳腺癌患者雌激素受体缺失(p=0.0197)和孕激素受体缺失(p=0.0215)显著相关。TRIM59在三阴性乳腺癌组织中的表达水平明显高于非三阴性乳腺癌组织(p=0.0157)。TRIM59表达量较高的患者生存时间低于TRIM59表达量较低的患者。　　TRIM59过表达可促进乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭及周期进展，并增强细胞对顺铂的化疗抵抗性。TRIM59过表达激活乳腺癌细胞中的AKT信号通路并促进p53的泛素化过程。