目的创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)是对严重应激源的一种异常精神反应,是应激精神疾病中最为典型的一种,随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的增多,PTSD发病率越来越高。现今,PTSD以其发病率、患病率高、慢性病程、难以治愈等特点,严重影响人们身心健康而备受关注。在严重创伤应激急性期,边缘系统为应激应答敏感区,其功能和应激联系密切。杏仁核作为边缘系统的重要组成部分,在恐惧、发怒和情感记忆中起重要的作用,因此可能在PTSD的发病中起重要作用。杏仁核是恐惧形成和表达的关键中枢。研究报道,Ca2+-CaM-CaMKIIa信号途径在活动依赖性长时程核基因表达、中枢神经可塑性、学习与记忆、精神与行为等多种认知活动中有重要作用。近年的研究显示,PTSD大鼠杏仁核神经元发生凋亡。线粒体在细胞凋亡的发生中起重要的作用,Caspase 9与凋亡启动有关,在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用。细胞凋亡时,线粒体的作用不容忽视,作为线粒体标志酶细胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)其活性变化可体现线粒体的功能状态,也反应细胞凋亡的状态。“单一连续刺激(single prolonged stress, SPS)"SPS动物模型是目前探讨PTSD发病机制的较理想的实验模型,该方法已经被国际所认同。因此本研究采用SPS方法刺激大鼠制作PTSD模型,并研究刺激后各时间段Ca2+-CaM-CaMKIIa的改变及线粒体标志性酶细胞色素氧化酶的表达,同时检测凋亡蛋白酶Caspase9的改变,旨在探讨PTSD大鼠杏仁核恐惧增强学习记忆改变的发生机制,为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。1、模型制作及分组采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS模型。其具体方法是将大鼠按连续进行下述步骤处理：固定刺激2小时后,立即强迫性游水20mmin,水深40cm,水温25℃；休息15min；乙谜麻醉至意识丧失；无干扰空间常规喂养。随机分为5组,即正常对照组及SPS1d、4d、7d和14d组。2、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测细胞内游离Ca2+浓度检测：取正常对照组及SPS1d、4d、7d、14d大鼠,经0.4%戊巴比妥麻醉,开颅取双侧杏仁核100mg,常规方法制备106-107/ml的细胞悬液,加入1 mmol/L Fura-2/AM置于37℃避光孵育40min；荧光分光光度计检测。3、CaM、CaMKⅡα的免疫组化免疫组化：分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑,制作冰冻切片,分别用PV法进行杏仁核的CaM、CaMKⅡα免疫组织化学染色,DAB显色,中性树胶封片,光学显微镜观察,摄片。4、CaM、CaMKⅡα及Caspase-9的Western Blotting、RT-PCRWestern Blotting:分别取新鲜杏仁核经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,提取上清蛋白,电泳,转膜,经封闭后分别加一抗4℃过夜；HRP标记IgG孵育2h, ECL发光,检测条带各光密度值。RT-PCR:断头取脑分离杏仁核,提取总RNA,进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳,成像并进行积分光密度分析。5、COX的酶组化及透射电镜技术观察灌流取冰冻切片,下降梯度PBS脱糖,孵育液37℃孵育半小时,甘油明胶封片,光镜下观察,摄片。常规电镜制样,倒扣包埋、聚合、半薄切片定位,AO超薄切片机进行超薄切片,透射电镜下观察。6、杏仁核Caspase 9免疫荧光结果1、杏仁核细胞内游离Ca2+浓度检测的结果应激组大鼠杏仁核细胞内游离Ca2+浓度于实验后12h明显高于对照组,24h增至高峰,至4d时仍明显高于对照组,14d恢复至正常。2、CaM及CaMKⅡα的免疫组化、Western Blotting及RT-PCR的结果PTSD大鼠杏仁核神经元CaM的各项表达于SPS 4d达高峰,SPS 7d和SPS 14d逐渐下降；CaMKⅡα的各项表达均于SPS 1d时最低,之后逐渐升高。3、COX酶组化及透射电镜结果光镜下,与正常对照组相比,SPS组杏仁核神经元COX阳性表达明显减少。电镜下,SPS后,杏仁核神经元出现线粒体肿胀,COX从线粒体释放入胞浆。4、Caspase 9的免疫荧光. Western Blotting及RT-PCR的结果PTSD大鼠杏仁核神经元Caspase 9的各项表达于SPS刺激后,出现逐渐上调的趋势,SPS 7d时达到高峰。结论1、PTSD大鼠杏仁核神经元Ca2+-CaM-CaMKⅡα信号途径调控紊乱。2、PTSD大鼠杏仁核COX酶从线粒体释放入胞质,Caspase 9表达上调,介导杏仁核神经元凋亡的发生。