禾谷类作物中,淀粉是种子胚乳中最主要的能量存储物质。稻米淀粉占80%以上,是人类食用的主要部分,也是决定稻米品质的关键因素。淀粉的合成是一个非常精细而且复杂的生物过程,涉及到大量淀粉合成酶类和调节因子的参与。水稻中胚和胚乳的发育息息相关,胚乳中的淀粉为胚的发育和种子萌发提供营养,而胚的正常发育关系到种子是否能正常萌发,种子萌发及其幼苗生长是植物生长周期的起点,制约其生物产量尤其是淀粉的合成。目前为止,虽然已有大量与淀粉生物合成和胚发育相关基因和调控因子被鉴定,但还有很多环节未知。因此,发掘新的与淀粉合成和胚发育相关的基因,研究其生物过程,对改良水稻品质、提高产量具有重要意义。在本研究中,我们在粳稻品种宁粳3号EMS诱变的突变体库中,筛选获得一个粉质胚乳突变体flo.3/+(floury endosperm13/+),该突变体纯合致死。通过图位克隆和转基因功能互补验证,确定该突变基因编码一个含408个氨基酸线粒体复合体Ⅰ附属亚基 NDUFA9(mitochondrial NADH dehydrogenase accessory subunit 9)。本研究表明OsNDUFA9具有多效性,在flo13突变种子中淀粉合成变缓,胚的发育也受到影响,线粒体的结构和功能都发生了改变。本文的主要研究结果如下:1.flo13突变的成熟种子表现为粉质胚乳,胚发育不正常且种子不能正常萌发。经TTC染色后发现绝大部分突变体种子的胚均未染上红色,种子无生活力,纵切剥壳浸种9小时后的成熟种子发现其无胚的形态建成。与野生型相比,突变体成熟种子的千粒重下降约30%,籽粒厚度显著减小,但总淀粉、直链淀粉的含量没有明显变化。2.突变体成熟种子横切面扫描电镜观察发现突变体的淀粉颗粒变小变圆,排列疏松;半薄切片观察发现,突变体胚乳里层细胞的胞质中,存在少量小的、零散分布的单粒淀粉颗粒,且发育明显滞后。突变体中胚乳外层细胞的淀粉积累也显著滞后于野生型。3.由于flo13纯合致死,因此将flo13/+杂合植株与籼稻品种9311配制杂交组合,利用F2群体将突变基因定位在第2染色体长臂标记S76-20与S76-17之间的38 kb的区段内,基因组测序发现基因Os02g0816800的编码区第18个碱基由G突变为A,造成蛋白翻译的提前终止。转基因功能互补结果证实了 Os02g0816800即为目标基因,编码线粒体复合体Ⅰ的一个附属亚基,将其命名为OsNDUFA9。4.水稻原生质体中的亚细胞定位研究显示OsNDUFA9定位于线粒体中。荧光定量和GUS活性染色实验表明,OsNDUFA9呈组成性表达,绿色组织中相对表达较高。5.荧光定量PCR结果表明,花后12天发育的胚乳中主要的淀粉合成酶ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADP Glucose Pyrophosphorylase,AGPase)的编码基因AGPL2、AGPS2b、AGPS1,淀粉合成酶(Starch Synthase)基因 GBSSⅠ、SSⅡa,淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme)基因 SBEⅠ、SBEⅡb,质体磷酸化酶(Plastidial Phosphorylase)基因PhoI等的表达量在flo13种子中都明显低于野生型,其中AGPS2b,AGPSL1,SSⅡa,SUS4,BEI,ISA2,PUL和Pho1的表达量仅为野生型的五分之一;成熟种子中部分淀粉合成相关蛋白积累量的降低也证实了这一结果。这表明OsNDUFA9通过影响水稻淀粉合成相关基因的表达影响淀粉合成。6.flo13突变种子中线粒体电子传递链(electron transfer chain,ETC)相关基因表达和蛋白的积累量也受到影响,交替氧化酶基因AOX的表达量显著提高;线粒体双层膜结构被破坏,线粒体嵴变少,基质稀薄。这表明突变体flo13的线粒体功能被破坏,电子传递链也受到损伤。综上所述,水稻中OsNDUFA9的功能缺失会导致线粒体功能缺陷,导致胚的发育和胚乳中淀粉合成受阻,影响淀粉合成和种子萌发。