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研究背景:气管移植是解决如原发性气道狭窄、气管粘膜损伤、气管肿瘤等疾病的主要手段。而气管移植后管腔大量纤维结缔组织生成,阻塞气管畅通,容易导致移植的失败,因此制约气管移植成功的关键是治疗移植后气管狭窄的问题。造成移植体狭窄病理因素主要包括:移植体过度纤维化形成的纤维瘢痕和气管再软骨化障碍,其机制尚不清楚。早期研究,利用缓释骨形态发生蛋白与表皮生长因子促进气管再软骨化的形成,一定得程度上解决了维持气管正常形态的问题,可是移植体大量纤维组织增生仍然未能解决。气管移植体中成纤维细胞和肌成纤维细胞的大量生成、排斥反应、炎性细胞的侵润,均是诱发气管移植体管腔中大量纤维结缔组织生成的主要原因。其中有关过度生成的成纤维细胞和肌成纤维细胞的来源主要包括,第一,是气管上皮细胞的病理转化;第二是骨髓干细胞的分化。气管移植体成纤维细胞和肌成纤维细胞多数由气管上皮细胞受病理刺激后转化而来,由骨髓干细胞分化而来的较少。上皮细胞的间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞的一种病理转化过程,即上皮细胞失去特性而获得间质细胞特性的转化过程,因此气管上皮细胞转化成纤维细胞和肌成纤维细胞的机制是本研究的的关注点。参与组织器官的纤维化和创伤愈合另一个主要因素是转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1),TGF-β1与受体结合,催化蛋白分子磷酸化,调节胶原蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂的转录基因表达,抑制细胞外基质降解,加强沉积,还促进纤维细胞的活化,并通过自分泌的方式持续促进组织纤维化。研究证实气管移植体狭窄处气管粘膜中TGF-β1的表达显著增高,因此TGF-β1增强EMT导致纤维组织过度增生,在气管移植体狭窄病理生理过程中扮演重要角色。微小RNA(MicroRNAs,MiRNAs)参与了多种细胞组织纤维增生、增殖、迁徙等生理病理过程,例如心肌纤维化、肺纤维化、肾小球纤维化、肿瘤细胞增殖迁移等,同时也在EMT的转化过程中发挥重要的调控作用。MiRNAs家族的分子较多,MiR-200c是明星分子之一,研究表明,在其他组织器官纤维化病理过程中MiR-200c可通过TGF-β通路调节EMT相关转录因子的表达,来实现对EMT的调控作用。目前对气管上皮细胞EMT过程中MiR-200c的调节作用研究较少。因此利用TGF-β1诱导的气管上皮细胞建立上EMT的体外细胞模型,探索MiR-200c对EMT的影响是本实验的重点。研究目的建立气管上皮细胞EMT的体外细胞模型,一定程度上模拟气管移植后移植体纤维结缔组织过度增生导致管腔狭窄的病理改变过程;在细胞模型的基础上,观察MiR-200c的表达高低与TGF-β1诱导的气管上皮细胞EMT模型的相关性,探究MiR-200c对治疗气管移植后移植体瘢痕狭窄的作用,为寻找预防和治疗同种异体气管移植后移植体狭窄的方法奠定理论基础。研究方法1、相同浓度TGF-β1诱导气管上皮细胞不同时段,定量PCR法检测上皮细胞EMT相关分子基因水平表达情况;Western-blot法和免疫荧光方法检测上皮细胞EMT相关标志蛋白表达情况;建立气管上皮细胞EMT模型,一定程度上模拟了气管移植后移植体发生纤维组织过度增生的情况。2、气管上皮细胞转染高表达或低表达MiR-200c,再由相同浓度TGF-β1诱导,用CCK-8法检测上皮细胞增殖能力;电子显微镜下观察上皮细胞形态;定量PCR法检测上皮细胞相关EMT分子基因水平表达情况;Western-blot和免疫荧光法检测EMT相关标志蛋白表达变化情况。研究结果1、相同浓度TGF-β1(10ng/ml)诱导气管上皮细胞0h、24h、36h、48h,定量PCR结果提示:上皮细胞EMT相关分子基因表达中,上皮标志物E-cadherin基因表达随时间的增加而下降,间质标志物Vimentin和α-SMA基因表达随时间的增加而升高;Western-blot法和免疫荧光法结果提示;上皮细胞EMT相关分子蛋白表达,上皮标志蛋白E-cadherin表达随时间的增加而下降,间质标志蛋白Vimentin和α-SMA的表达随时间的增加而升高,表明成功建立了气管上皮细胞EMT的体外细胞模型,充分模拟了气管移植后移植体大量纤维组织增生导致管腔狭窄的病理过程;2、下调气管上皮细胞MiR-200c表达且TGF-β1刺激诱导,CCK-8检测上皮细胞增殖能力提示:较单独TGF-β1诱导组,下调+TGF-β1诱导组细胞增殖能力趋向于增殖能力强的间质细胞;倒置显微镜下观察细胞形态提示:较单独TGF-β1诱导组,下调+TGF-β1诱导组上皮细胞形态趋向于紧密连接消失的间质细胞;上调气管上皮细胞MiR-200c表达且TGF-β1刺激诱导,CCK-8检测上皮细胞增殖能力提示:较单独TGF-β1诱导组,上调+TGF-β1诱导组细胞增殖能力趋向正常上皮细胞;倒置显微镜下观察细胞形态提示:较单独TGF-β1诱导组,上调+TGF-β1诱导组上皮细胞形态逆转,趋向于正常鹅卵石样形态;3、下调气管上皮细胞MiR-200c表达且TGF-β1刺激诱导,定量PCR检测上皮细胞EMT相关分子基因表达:较单独TGF-β1诱导组或单独下调MiR-200c组,下调+TGF-β1诱导组上皮标志物E-cadherin基因表达量显著下降,间质标志物Vimentin和α-SMA基因表达量显著升高;4、下调气管上皮细胞MiR-200c表达且TGF-β1刺激诱导,Western-blot和荧光免疫法检测上皮细胞EMT相关蛋白表达:较单独TGF-β1诱导组或单独下调MiR-200c组,下调+TGF-β1诱导组上皮标志蛋白E-cadherin表达量下降显著,间质标志蛋白Vimentin和α-SMA表达量显著升高;上调气管上皮细胞MiR-200c表达且TGF-β1刺激诱导,Western-blot和荧光免疫法检测上皮细胞EMT相关蛋白表达:较单独TGF-β1诱导组,上调+TGF-β1诱导组上皮标志蛋白E-cadherin蛋白表达量逆转增加,间质标志蛋白Vimentin和α-SMA表达量逆转下降,均有统计学差异;研究结论结论表明,气管上皮细胞中MiR-200c的低表达可增强TGF-β1诱导的EMT过程;MiR-200c的高表达可抑制TGF-β1诱导的EMT过程。因此MiR-200c在抑制气管上皮细胞受病理刺激生成成纤维细胞和肌成纤维细胞的过程中发挥着重要作用,由此推测MiR-200c可能在气管移植后移植体大量纤维组织生成导致的管腔狭窄过程中同样发挥着重要作用,在预防和治疗气管移植后移植体狭窄中具有潜在的应用前景。