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猪圆环病毒(Porcine Circovirus, PCV)是最小的一种动物病毒,含有ORF1和ORF2两个主要的开放阅读框(Open Reading Frame),分别编码复制相关蛋白Rep和结构蛋白Cap。PCV有PCV1和PCV2两种血清型,其中PCV2对猪体有致病性。PCV2可损害免疫器官,导致免疫抑制,易继发其他病原的混合感染,引起猪圆环病毒病(Porcine Circovirus Associate Disease, PCVAD),如断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、猪皮炎’肾病综合征(Porcine Dermatitis and NepHropathy Syndrome, PDNS).猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRSV).关节炎等,其中PMWS可造成猪体严重的免疫抑制,给养猪业的发展带来经济损失。猪圆环病毒2型ORF2编码的Cap蛋白,是PCV2的主要结构蛋白,包含多个B细胞表位与中和表位,具有良好的抗原性,可以诱导猪体产生保护性免疫应答。PCV2抗体检测技术有ELISA、IPMA、IFA等,其中ELISA方法一次可检测大量血清样品,结果判定易于标准化,更适用于临床血清的大量检测。目前我国商品化的PCV2 ELISA抗体检测试剂盒,都是间接ELISA检测方法,对抗原纯度要求较高,并可能出现假阳性的结果。为了克服这些缺点,本实验室以5H7酶标鼠单抗为基础,建立了PCV2 Cap蛋白的阻断ELISA抗体检测方法。本研究以此为基础,组装了检测PCV2抗体的阻断ELISA试剂盒,并应用试剂盒对临床血清进行了检测,评价试剂盒的各项指标。本研究的具体内容如下：1.PCV2阻断ELISA抗体检测试剂盒各组分的制备根据已建立的PCV2 Cap蛋白阻断ELISA抗体检测方法,本研究分别制备了试剂盒中所需的各个组分,包括Cap蛋白、抗原包被板、标准阴性阳性对照血清、HRP-5H7酶标鼠单抗工作液、TMB显色液、终止液、样品稀释液、10×浓缩冼涤液,并对其进行的鉴定,结果表明：表达纯化后的重组Cqp蛋白经SDS-PAGE鉴定,在41kDa处有明显的条带且无明显杂带,符合重组蛋白大小,抗原性好；标准阴、阳性对照血清经Western-Blot分析,阳性血清在41kDa处与Cap蛋白有反应条带而阴性血清无；5H7酶标鼠单抗工作液经Western-Blot鉴定,与Cap蛋白在41kDa有反应条带；TMB显色液能与辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase, HRP)标记的5H7单抗正常反应,表明制备的试剂盒各组分符合各试剂的要求。2.PCV2阻断ELISA抗体检测试剂盒各组分的质量检测为了保证试剂盒各组分的质量,本研究从性状检验、无菌检验、效价检验等各方面对制备的试剂盒各组分进行了检验。结果表明：表达纯化后的重组Cap蛋白,纯度高,3个不同批次蛋白间重复性好且浓度都在08mg/mL以上；包被Cap抗原的酶标板光滑无裂痕,真空密封良好无漏气；标准阴性阳性对照血清无菌检验合格,PCR和ELISA检测符合标准；HRP-5H7酶标鼠单抗工作液无菌检验合格,效价检测均大于1：3000；显色液、终止液、样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、终止液经性状检验、无菌检验符合标准。说明制备的试剂盒各组分质量合格,符合试剂盒的要求。3.PCV2阻断ELISA抗体检测试剂盒的组装与保存本研究将试剂盒中关键组分用相应的保护剂处理,然后组装成抗体检测试剂盒,采用30份PCV2阳性血清检测,其PCV2抗体效价为1：32-256,对猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪流感病毒(SIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、PCV1和大肠杆菌阳性血清检测,结果都呈阴性,说明该试剂盒敏感性和特异性较好。试剂盒分别置于37℃和4℃保存,进行了加速试验和4℃保存试验。结果表明：试剂盒各组分及组装成的试剂盒,在37℃加速7天能表现出良好的稳定性；在4℃长期保存12个月性状及性能保持稳定。说明该组装的试剂盒在保存期间性质稳定且良好,能用于临床血清的大量检测。4.PCV2阻断ELISA抗体检测试剂盒的应用为了研究本试剂盒在临床中的应用效果,本研究应用组装好的阻断ELISA试剂盒,检测不同疫苗免疫猪群、PMWS发病猪群与好转健康猪群、不同猪场不同年龄段猪群的血清抗体水平,分析评价疫苗免疫效果及猪群中血清抗体分布情况,并比较与商品化试剂盒检测临床血清的符合率。检测结果表明：不同免疫组之间抗体变化规律基本类似,且抗体水平差异不明显,其中油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高；PMWS发病猪群血清抗体水平较同群好转健康猪高；不同年龄段中育肥猪群血清抗体水平较高；与商品化试剂盒的符合率为90.91%。说明该阻断ELISA抗体检测试剂盒敏感性高、特异性强,能很好的区分不同猪体血清抗体水平,有效的评价疫苗免疫效果,适用于临床血清的大量快速检测。综上所述,本研究成功的组装了猪圆环病毒2型Cap蛋白阻断ELISA抗体检测试剂盒,通过质量检测和加速保存试验,结果显示试剂盒良好的稳定性,通过检测临床猪群血清抗体水平,结果显示试剂盒能快速有效的区分不同猪群血清抗体的差别,说明该试剂盒具有一定的有效性、灵敏性和特异性,本研究为该阻断ELISA试剂盒的最终商品化提供一定的试验依据。