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子宫是一个独特的生殖器官,在孕激素(P4)和雌激素(E2)序贯性作用下,通过孕激素受体(PR)和雌激素受体(ER)发挥作用,使得子宫内膜形态和功能经历着周期性、特征性改变,包括子宫内膜的增殖,分化,在未受孕情况下的崩解及相伴的出血等现象,构成了完整的月经周期。而且子宫内膜组织是女性体内唯一周期性的主动“创伤”(子宫内膜发生崩解,蜕膜化细胞发生凋亡或者坏死),主动快速修复,不留任何疤痕的组织。孕激素撤退被认为是流产和月经发生(内膜崩解)的关键因素,同时也是啮齿类动物分娩的重要原因。啮齿类动物在分娩前,母源性血清中孕激素迅速下降导致子宫收缩,从而顺利分娩。但是在人类和几内亚猪的研究发现,整个妊娠期直到分娩,孕激素浓度一直高位存在。但发现PR亚型PR-A的表达迅速升高,从而使孕激素从受体水平受到了拮抗,即功能性孕激素撤退。孕激素维持子宫内膜的蜕膜化反应,但我们在研究埋植孕激素小鼠模型中观察到在孕激素维持作用下子宫内膜依然崩解,并发现氧化应激OS-NF-κB信号通路激活。诱导蜕膜化细胞模型中也同样观察到孕激素维持下NF-κB信号通路激活和细胞凋亡,推测孕激素维持下,存在功能性孕激素撤退并激活炎症信号通路导致内膜崩解和细胞凋亡。目的:利用小鼠月经模型,通过ROS抑制剂干预,探讨孕激素维持状态下内膜崩解的分子机制。方法:取40只8-10周龄雌性C57BL/6J小鼠在乙醚麻醉情况下行双侧卵巢切除术,恢复一周以清除内源性激素。然后按照下列时程进行序惯激素处理:在第1-3 d的AM 9:30每只皮下注射100 ng雌二醇;在第4-6 d不给予任何处理;在第7 d,将孕酮皮埋管埋植于小鼠背部皮下,同时每只小鼠皮下注射5 ng雌二醇和50 ng孕酮;在第8、9 d的AM 9:30,继续每只皮下注射5 ng雌二醇;在第9天的AM 11:30,在第9天的AM 11:30,小鼠双侧子宫角各注射15μl过滤除菌的花生油诱导蜕膜化,并同时详细记录每只小鼠花生油注射的时间。蜕膜化诱导2 d后,即小鼠在第11 d的AM 11:30(将此时间点作为孕激素维持的0 h),取20只小鼠在48 h,60 h,72 h分别给予ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC),然后分别在0 h,24 h,48 h,60 h,72 h,96 h处死小鼠,取下子宫拍照,取部分组织迅速放入液氮中冷冻,用免疫组化和westernblotting分析NF-κB在细胞核与细胞质中的表达;采用免疫共沉淀检测NF-κB与PR的相互作用;采用试剂盒测定小鼠子宫中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性以及超氧阴离子(O2·-)的含量。剩余部分浸入4%多聚甲醛,一部分组织做苏木精-伊红(H&E)染色,用于病理形态学的检查;剩余部分采用免疫组化方法检测核转录因子NF-κB入核情况以及孕激素受体PR的定位。结果:1血清孕激素水平的测定结果显示,在不同时间点小鼠血清中的孕激素含量基本一致,约为40 ng/ml。2小鼠子宫外观形态和组织学观察从外观形态学观察,在0-48 h,子宫颜色为粉红色,但随时间增加子宫出现充血水肿。60-72 h时子宫颜色为深红色,水肿加剧,可观察到暗红色出血点,子宫横断剖开后可见暗红色内容物。在96 h,子宫颜色为暗红色,子宫横断剖开后,暗红色内容物迅速流出,与孕激素撤退后的16 h子宫形态相似。给予NAC处理后的96 h,子宫颜色较同时间点的子宫颜色浅,且充血水肿程度明显减小。组织学观察结果显示,在0-48 h,子宫内膜蜕膜化程度较为充分,子宫内膜结构完好。但随时间推移蜕膜化中心区域己经有极少数核固缩的基质细胞。60-72 h,在整个蜕膜化中心区域核固缩的基质细胞数目增加,部分区域出现小范围的崩解脱落。在96 h,蜕膜化中心区域的核固缩的基质细胞明显增加,在蜕膜化中心区域的外周区域己经观察到明显的崩解脱落现象,与孕激素撤退后的16 h相似。给予NAC处理后的96 h,在蜕膜化中心区域核固缩的基质细胞较未用NAC处理的明显减少,崩解脱落现象不明显。3小鼠子宫组织中O2·-和SOD的变化观察发现小鼠子宫中O2·-的水平和SOD的活性在孕激素维持的48 h内没有显著性变化,但在72 h,O2·-的水平与SOD的活性显著增高。O2·-的水平和SOD的活性作为氧化应激反应的标志物,它们的升高表明子宫内氧化应激反应在孕激素维持的72 h达到一个高水平。给予NAC处理后,在72 h,O2·-的水平较未用NAC处理的降低,而SOD的活性升高,说明NAC抑制了子宫内的氧化应激反应。4 NF-κB信号通路的激活采用免疫组化方法,观察NF-κB p65蛋白是否入核。在0 h,p65主要在细胞质中表达,随时间的推移,p65由细胞质进入细胞核。为了进一步证实NF-κB的激活,分别提取各组子宫组织的核蛋白和质蛋白,用western blotting来半定量核与质中p65的表达量,从而评价NF-κB的活性。核蛋白中p65的含量逐渐增加,在72 h达到最大值,而在质蛋白中,p65的表达量逐渐减少,在72 h表达量最低。5 PR与NF-κB的相互作用采用免疫组化方法,对PR蛋白进行定位。结果显示,PR在细胞核中持续表达。为了证明PR与p65的相互关系,分别提取各时间点子宫组织蛋白,加入兔抗p65多克隆抗体对蛋白进行免疫沉淀,用抗PR抗体进行western blotting分析发现,p65可被PR抗体沉淀,并且随着时间的延长二者的结合量逐渐增加,在72 h达到高峰。该结果表明,在体内,PR与p65之间存在相互作用。结论:研究结果表明在孕激素维持状态下发生的子宫内膜崩解与OS-NF-κB信号通路的激活有关。其机制可能为,在孕激素维持状态下,子宫内膜发生氧化应激反应,进而激活NF-κB p65蛋白,p65与孕激素受体PR结合,抑制了孕激素与其受体的结合,导致孕激素功能性的撤退,从而参与孕激素维持状态下的子宫内膜的崩解的过程。