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载脂蛋白M(apoM)是1999年由瑞典隆德大学的Xu和Dahlb(a|¨)ck首先发现和分离的一种新型人类载脂蛋白,主要存在于血浆高密度脂蛋白HDL中。ApoM通过影响前β-HDL的形成调节胆固醇的出胞,是HDL代谢的重要调节因子,可能具有抗动脉粥样硬化的保护作用。ApoM的表达和分泌受多种因子的调节,与冠心病、糖尿病以及其他脂质代谢紊乱的疾病关系密切。糖尿病人患者血浆apoM水平明显下降。汉族人群中apoM基因近端启动子单核苷酸多态性T-778C与血浆胆固醇和空腹血糖相关,并可能增加罹患2型糖尿病的风险。糖尿病小鼠肝脏和血清apoM均显著下降,外源性的胰岛素可部分逆转这一趋势。细胞实验发现胰岛素、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor I,IGF-I)和IGF-1功能肽(IGF-I potential peptide, IGF-IPP)可明显抑制人类肝癌细胞株apoM mRNA的表达,且呈时间和剂量依赖性。但这种体内和体外实验结果不一致的原因尚不清楚。实验发现高糖本身则具有抑制载脂蛋白M的表达和分泌的作用,但具体机制不明。研究发现高血糖可激活体内氨基己糖途径,导致内源性葡糖胺生成增加,糖基化代谢产物增多。氨基己糖代谢通路是糖酵解的一大分支,我们推测高糖抑制apoM的表达和分泌是否是通过氨基己糖途径来是实现的,而葡糖胺是模拟体内氨基己糖代谢通路最常用的物质,所以研究葡糖胺对apoM代谢的影响有助于了解高糖抑制apoM表达的原因。葡糖胺是构成体内粘多糖和壳质的一种含氨基单糖,通过糖代谢的重要分支氨基己糖途径进行代谢,具有重要的生理功能。临床试验发现常规剂量的葡糖胺对体内糖代谢稳态无明显影响,但各种病理条件下氨基己糖代谢通路过度激活后会引起一系列基因表达的改变,导致葡萄糖利用障碍和胰岛素抵抗,引起糖代谢和脂蛋白代谢的变化。但其他研究发现,葡糖胺可明显减轻高血糖对血管的损伤,并具有调节脂蛋白基因表达和蛋白合成的作用。葡糖胺通过内质网应激强化载脂蛋白B-100共翻译期的蛋白酶水解作用和翻译后的非蛋白酶降解作用而特异性地减少载脂蛋白B-100的分泌。葡糖胺通过延长载脂蛋白A1mRNA的半衰期,促进其基因表达和蛋白分泌。葡糖胺对apoM的影响目前尚不清楚,研究两者之间的联系有助于更好地了解氨基己糖途径对体内脂蛋白代谢以及动脉粥样硬化过程的影响,使其成为临床治疗糖尿病、肥胖症、高胰岛素血症和其他脂质代谢异常的疾病的新靶点。第一部分葡糖胺对人肝癌细胞株载脂蛋白M基因表达的影响目的:研究葡糖胺在体外对人肝癌细胞株HepG2细胞apoM和apoA1mRNA表达的影响。方法:通过在人肝癌细胞株HepG2细胞培养液中加入不同浓度的葡糖胺(0、1 mmol/L和5 mmol/L)孵育24小时后提取细胞,实时定量PCR法检测apoM和apoA1 mRNA的表达水平。结果:细胞实验发现各组apoM mRNA和apoA1 mRNA水平有差异。1mol/L葡糖胺组apoM mRNA水平较对照组增加60%(P<0.05),而5mol/L组apoMmRNA增加47.7% (P>0.05)。1mol/L和5mol/L组apoA1 mRNA较对照组分别增加1.03倍(P>0.05)和2.59倍(P<0.05)。结论:葡糖胺可促进人肝癌细胞株HepG2细胞apoM和apoA1的基因表达。第二部分葡糖胺对健康SD大鼠载脂蛋白M表达和分泌的影响目的:了解外源性葡糖胺对健康成年SD大鼠apoM表达和分泌的影响。方法:采用健康成年SD大鼠尾静脉置管,使用微量注射泵以2.5ml/h速度连续6小时泵入不同浓度的葡糖胺(1 mmol/L和10 mmol/L),对照组以同样方法泵入生理盐水,Western-blot法检测大鼠血清apoM的浓度变化,RT-PCR法检测apoM mRNA的水平,同时检测血糖、胰岛素、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、胆固醇、甘油三酯和脂蛋白a的变化。结果:动物实验发现SD大鼠尾静脉连续灌注葡糖胺6小时后,肝脏apoM mRNA水平有明显差异(H=7.344,P=0.0254)。1mmol/L葡糖胺组较生理盐水对照组肝脏apoM mRNA水平升高9.6%(P>0.05),而10mmol/L葡糖胺组升高3.40倍(P<0.05)。血清apoM蛋白水平仅轻度增加,差异无统计学意义(H=0.98,P=0.6126)。同时10mmol/L葡糖胺组HDL水平较对照组显著升高20.3%,差异有统计学意义(P<0.05),而甘油三酯、脂蛋白a和低密度脂蛋白无明显变化。结论:葡糖胺促进健康成年SD大鼠肝脏apoMmRNA的表达,血清apoM蛋白水平也轻度增加。短时间的高葡糖胺状态对血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和Lp(a)影响不大,但高密度脂蛋白明显升高,提示葡糖胺可能具有促进HDL合成的作用,与apoM的变化趋势相一致。第三部分葡糖胺调节载脂蛋白M表达和分泌的机制研究目的:通过加入氨基己糖代谢途径关键限速酶GFAT的抑制剂azaserine,了解氨基己糖代谢通路对载脂蛋白M的影响。同时通过分别加入葡糖胺或胰岛素,了解葡糖胺调节apoM的具体调节机制。方法:①A组为对照组,B组加入5umol/L azaserine,C组加入5umol/L azaserine + 10mmol/L葡糖胺,培养24小时后提取细胞,实时定量PCR法检测apoMmRNA的表达水平。②A组为对照组,B组加入5mmol/L葡糖胺,C组加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰岛素,培养24小时后提取细胞,实时定量PCR法检测apoM和apoA1 mRNA的表达水平。③A组为对照组,B组加入20umol/L azaserine,C组加入1ug/ml胰岛素+20umol/L azaserine,D组加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰岛素+20umol/L azaserine,培养24小时后提取细胞,实时定量PCR法检测apoM和apoA1 mRNA的表达水平。结果:①培养基中加入5umol/L azaserine后apoM mRNA水平较对照组下降35.4%(P<0.05),而外源性葡糖胺则可逆转这一趋势,使apoM mRNA恢复至对照组水平。②单纯5mmol/L葡糖胺可使人肝癌细胞株HepG2细胞apoM mRNA水平较对照组显著升高51.1%(P<0.05),而5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰岛素组apoM mRNA水平较对照组升高78.2%(P<0.01)。③葡糖胺+胰岛素+azaserine组apoMmRNA水平较单纯azaserine组升高120%(P<0.05),较胰岛素+azaserine组升高68.9%( P<0.05)。葡糖胺+胰岛素+azaserine组apoA1 mRNA水平较单纯azaserine组升高3.6倍(P<0.01),较胰岛素+azaserine组升高1.85倍(P<0.01)。结论:葡糖胺通过氨基己糖通路调节apoM的基因表达,而且内源性和外源性氨基己糖对apoM的生成同样重要。胰岛素可显著加强葡糖胺对apoM表达的促进作用,但胰岛素本身不是促进apoM mRNA表达的主要原因。高血糖抑制apoM的表达和分泌的机制不是通过激活氨基己糖代谢通路途径来实现的。