鞘氨醇单胞菌来源的新型P450单加氧酶的异源表达及催化特性分析

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细胞色素P450单加氧酶分布广泛且催化能力强,被称为自然界中底物广谱性最强的生物催化剂,参与人体多种内源性物质及外源性物质的代谢,并在体外也能够催化多种反应。本实验室为开发更多高效稳定的细胞色素P450,通过生物信息学方法从基因库中检索了维氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas wittichii RW1)来源的P450基因(简称P450SpMO),在大肠杆菌中异源表达,然后对其酶学性质及催化特性开展了基础研究。主要结论如下:(1)通过基因工程将P450SpMO质粒重组,然后将P450Sp MO酶在大肠杆菌中进行异源表达,得到86 kDa的可溶性目的蛋白。发现6His-tag设计在N端时,目的蛋白的表达效果较好。(2)P450SpMO是属于VII类的CYP116B亚家族的新型P450,具有典型的P450吸收光谱。酶学性质研究表明重组P450SpMO酶的最适pH为6.5,最适温度为35°C,并且在30°C时有良好稳定性。测得米氏常数Km为0.626 mmol/L,Vmax值为0.0169μmol/(mg·min)。(3)重组P450SpMO酶的体外催化研究表明,该酶不仅能够催化硫醚的氧化,还能使含甲氧基化合物发生O-脱烷基化反应,并且电子共轭效应和空间位阻等因素会影响P450SpMO酶的催化活性。以上实验表明P450SpMO酶是一种多功能P450单加氧酶,在有机合成中具有较大的应用潜力。
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