论文部分内容阅读
背景与目的：由于与功能基因的紧密相关性以及在基因组进化过程中的重要性,假基因功能已引起了国内外学者的广泛注意。我们前期研究发现Cripto-1基因在许多恶性肿瘤中高表达,且呈现出大肠癌器官特异性肝转移的特性,但是其假基因Cripto-3(Cr-3)在大肠癌中的作用和机制尚不清楚。本研究首先观察并初步了解假基因Cripto-3在人大肠癌发生发展中的作用,并探讨Cripto-3表达对大肠癌细胞生长、克隆形成及侵袭的影响。并进一步从基质金属蛋白酶角度探讨了Cr-3调控癌细胞生物学行为的分子机制。方法：1,收集人大肠癌和正常大肠黏膜组织,采用荧光实时定量PCR方法检测组织中mRNA水平,并分析其表达水平与淋巴结转移、临床分期的相关性。培养大肠癌细胞株,采用荧光实时定量PCR方法检测各细胞株中mRNA不同表达水平,并选择Cripto-3表达最高者SW-620细胞和最低者HCT-116细胞为下一步研究对象。2,构建Cr-3真核表达质粒和Cr-3小干扰RNA(siRNA)。HCT-116细胞分为3组：空白对照组(Con-A)、空载质粒对照组(Con-B)和Cr-3过表达质粒组(Cr-3),其中,Cr-3组以Cr-3真核表达质粒转染处理。分别用MTT法和平板克隆试验检测各组癌细胞生长能力,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,并作统计学处理。3,构建并用化学方法合成Cr-3siRNA。SW-620细胞分为3组：空白对照组(con-a)、空载质粒对照组con-b和Cr-3siRNA组(siRNA),其中,siRNA组以Cr-3siRNA转染处理。分别用MTT法和平板克隆试验检测各组癌细胞生长能力,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,并作统计学处理。4,为进一步深入探讨Cr-3在大肠癌发生发展中的作用和分子机制,本课题组进一步采用荧光实时定量PCR方法和蛋白质印迹方法检测2、3各实验组基质金属蛋白酶家族中MMP-2, MMP-7和MMP-9基因mRNA和蛋白水平。结果：1,在政策大肠黏膜组织中,Cr-3mRNA水平极低,在大肠癌组织中,Cr-3mRNA呈高表达,统计学分析,差异十分显著(P<0.01);Cr-3mRNA高表达与癌细胞侵袭和淋巴结转移密切相关,而与组织类型无关；在4株大肠癌细胞株中,Cr-3mRNA均有不同程度的表达,其中HCT-116中Cr-3mRNA最低,SW-620细胞中最高；2,以Cr-3真核表达质粒转染Cr-3低表达者大肠癌HCT-116细胞株,MTT结果显示,72h Con-A、Con-B和Cr-3组相对增值率分别为0.761±0.026、0.764±0.034和0.848±0.008(P<0.05);平板克隆结果显示,Con-A、Con-B和Cr-3组分别为75±6、76±5和119±3(P<0.05)；Transwell结果显示,Con-A、Con-B和Cr-3组穿膜细胞数分别为444±4、45±5和76±6(P<0.05);3,以Cr-3siRNA转染大肠癌SW620细胞株后,MTT结果显示,72h con-a、con-b和siRNA组相对增殖率分别为0.927±0.037、0.922±0.035和0.663±0.018(P<0.05)；平板克隆结果显示,con-a、con-b和siRNA组分别为23±3、24±3和12±3(P<0.05)；Transwell结果显示,con-a、con-b和siRNA组穿膜细胞数分别为38±4、40±3和8±1(P<0.05)；4,荧光实时定量PCR和蛋白质印迹结果显示,与大肠癌HCT-116细胞Con-A组比较,Cr-3过表达组MMP-2、MMP-7和MMP-9mRNA和蛋白水平明显升高；,与大肠癌SW620细胞con-a组比较,siRNA转染组MMP-2、MMP-7和MMP-9mRNA和蛋白水平明显均明显下调。结论：1,假基因Cr-3在大肠癌中过表达,并与癌细胞的侵袭、转移密切相关；2, MMPs家族成员MMP-2、-7和-9在Cr-3调控大肠癌细胞侵袭和转移中发挥着重要作用；3,假基因Cr-3可能是大肠癌基因诊断和治疗中重要靶点之一,深入探讨其作用和分子机制,将有助于提高转移性大肠癌的综合诊疗水平。