研究背景：癌症的致命性不仅归咎于原发性肿瘤,而更因为转移的发生。目前针对晚期患者的治疗并不十分有效,至多能略微延长存活期。为了显著降低癌症的死亡率,有必要研发新的、同时针对原发和转移肿瘤抗癌疗法。旨在建立这样一种抗癌机制,本项目推荐将OLA1 (Obg-like ATPase),一个我们近年来发现并致力研究的细胞应激蛋白,作为新的药物靶点。OLA1是普遍表达于细胞浆中的属于Obg家族的ATP水解酶(ATPase).Obg族类的ATPase在进化中高度保守,见于从细菌到人的所有生物中,它们的具体生物学功用却鲜为人知。在现有的文献资料中除了本研究小组发表的论文外,只有个别的针对人类OLA1的研究。我们于2009年首先阐明OLA1是一个与氧化应激反应有关的内源性负性调控因子。用RNA干扰技术降低OLA1的表达(knockdown),细胞的氧化应激反应会由于一些转录后的机理被加强。随后我们又发现,如果肿瘤细胞的OLA1被knockdown,它们的体外迁移和侵入性能即会被显著削弱。由此我们设想,是否可以应用下调OLA1所产生的有利效应,研讨针对OLA1设计抗肿瘤转移治疗的可行性。因为基因剔除(knockout)小鼠是现今研究基因体内功能最为可靠的动物模型。并且在药物靶鉴定(target validation)的领域中,分析knockout小鼠的表型是为模拟该药物靶被完全抑制后全身反应(包括正性的期望疗效和负性的毒性作用)的首选程序,我们在本项目中引进了knockout小鼠模型,并对其开展了表型研究。这是本项目的设计思路之一。本项目的另外一个重要目的是要进一步阐明OLA1作用的分子生物学机理。虽然我们的前期研究指向OLA1对细胞氧化还原平衡(redox equilibrium)的影响,但是没有找到它作用的代谢通道(pathway)。我们意外地发现,OLA1可能是一种特殊的蛋白质翻译后修饰机制(PTM)的调节因子,它负性地调节蛋白质S-谷胱甘肽修饰(S-glutathionylation)。S-glutathionylation是蛋白质中半胱氨酸上的巯基(-SH)与胞浆中氧化型谷胱甘肽(GSH)通过巯基-硫醚交换形成的混合型二硫键(P-SSG),可逆性地发生于高氧胁迫(oxidative stress)状态并存在于非胁迫的基线状态。S-glutathionylation与另一种著名的PMT,蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)在原理上很相象,有人推断,S-glutathionylation是与蛋白质磷酸化平行,并交互影响的一种重要的蛋白质活性调控和信号传导机制。但是由于缺乏对该通道上游调控因子的定位分析,该领域只限制于小规模的研究,未得到应有的重视。我们认为,如果OLA1对S-glutathionylation的调节功能能被肯定,其结果将不仅有助于演绎OLA1的应用价值,比如作为抗肿瘤的药物靶,而且将促进有关PTM基本生物学现象的基础研究。因此,沿着这一研究方向,进行了细致的分子生物学论证。研究内容：(一)体内Olal knockout研究：为了深入阐明OLA1的体内生物学功能,我们建立了一株knockout小鼠,其中的Olal基因因被逆病毒载体的插入而灭活。发现～85%的纯合子(-/-)小鼠在围产期阶段死亡。但是幸存的-/-小鼠可以到成年,没有表现显著的健康问题,但是个体比野生型(+/+)和杂合型(+/-)小鼠持续小20-30%。胚胎研究发现,这一生长迟缓现象最早发生于胚胎发育的第10.5天,围产期死亡的原因是肺部发育不全。我们采取了小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)进行体外原代培养,也发现-/-MEF有生长减缓和细胞周期阻滞。这些结果表明OLA1是维持体内细胞产前产后正常生长的重要基因。但是OLA1的整体缺失,并不造成发育缺陷和幸存成年鼠的健康问题。(二)OLA1作为抗肿瘤药物靶的体外研究：我们既往的研究发现,OLA1的knockdown会造成体外培养的人乳癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵入滞缓。在本研究中,我们进一步发现,OLA1 knockdown导致乳癌细胞对Anoikis(贴附失缺性调亡)的敏感性显著增高。最后,应用稳定性RNA干扰技术,我们证实OLA1knockdown会造成MDA-MB-231稳定细胞株的生长速度减缓,与上述体内的knockout结果对应一致。综合我们既往的和现在的发现,对OLA1的靶向灭活至少会获得如下4项对抑制肿瘤恶性表型有利的效果：(1)↓肿瘤细胞生长,(2)↓迁移,(3)↓侵入,以及(4)↑Anoikis。因此我们推荐OLA1可作为抗肿瘤或抗肿瘤转移的药物靶,进入下一阶段的体内target validation的研究。(三)OLA1作为S-glutathionylation调节因子的分子机理研究：应用针对P-SSG的特殊Western blot和Slot blot技术,发现,在OLA1 knockdown的多种体外培养人类细胞中,细胞骨架蛋白actin和诸多其他蛋白具有显著增高的基线水平P-SSG。OLA1水平与整体(globe)P-SSG的负相关性也显现于经受氧化剂刺激(双氧水和巯基氧化剂diamide)的细胞中。这一规律也在原代培养的刚从体内制备的Ola1-/-MEF中被证实。我们推断,OLA1对S-glutathionylation调节功能是通过其调控直接参与S-glutathionylation加成的酶类比如GSTπ(谷胱甘肽S-转移酶)的稳定性。OLA1与GSTπ的结合反应也已被初步证实。根据这些结果,我们提出OLA1其实是先前尚未发现的S-glutathionylation上游调控因子之一。结论与创新：(1)本研究发现OLA1,一个首先由我们发现的新的氧化应激反应因子,是哺乳动物体内一个重要的与维持生长有关的基因。(2)OLAl参与调节重要的基本生物学过程,包括S-glutathionylation,一个重要的蛋白质翻译后修饰和信号传导通道。这些发现有助于今后建立靶向OLA1的独特的抗肿瘤/抗转移新药,并增进人们对一些基本生物学现象,比如PTM的知识。(3)OLA1是一个有继续研发价值的抗肿瘤或抗肿瘤转移的药物靶。