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目的: DY3002（新型二苯胺基嘧啶类衍生物）的抗肿瘤活性、安全性评价及作用机制研究，旨在发现对肺癌耐药活性好、选择性高的EGFRT790M突变型抑制剂。 研究方法: 本实验第一部分观察DY3002对NSCLC的作用效果。1.以Rociletinib、Osimertinib和Gefitinib作为阳性对照药，采用发光法测定了DY3002对野生型EGFR酪氨酸激酶及T790M位点突变的EGFR酪氨酸激酶的半抑制浓度(IC50);2.采用CCK-8法测定了化合物DY3002在24h、48h、72h作用下对各实验细胞的IC50值;3.采用AO/EB荧光双染法和DAPI染色法从形态学考察了DY3002对野生型A431和耐药型H1975肿瘤细胞株凋亡的影响。4.ROS检测分析法验证DY3002对肿瘤细胞内活性氧片段的影响。5.应用流式细胞仪定量分析DY3002对A431和H1975细胞周期的影响;以AV-PI双染流式细胞技术来考察DY3002对肺癌细胞A431和H1975凋亡的影响;6.采用划痕实验和Transwell检测DY3002对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。7.DY3002在体外激酶水平及细胞水平都表现出了良好的抗肿瘤活性和突变选择性，因此，本实验进一步采用裸鼠皮下移植瘤实验验证DY3002的体内抗肿瘤活性。第二部分观察DY3002对正常细胞的毒性作用及对血糖的影响。采用CCK-8法测定了化合物DY3002在72h作用下对正常细胞（气道上皮细胞和肝细胞）的IC50值;应用罗氏血糖仪检测DY3002对大鼠血糖的影响。第三部分:对DY3002对NSCLC干预机制进行研究。1.利用AutoDock4.2软件进行分析对接分析，研究DY3002与EGFRT790M激酶在空间结构上通过哪几种作用力相结合。2.为明确DY3002的作用机制，采用Western Blotting方法对H1975和A431细胞EGFR的激活和下游信号通路中的关键蛋白AKT、ERK及其活性形式P-AKT，P-ERK的影响进行研究。 结果: 观察DY3002的作用效果:(1) DY3002对突变型EGFR激酶(EGFRL858R/T790M)有强烈抑制作用， IC50仅仅为0.71nM，而对于野生型EGFR激酶(EGFRwild-type) IC50值高达448.7 nM。与Rociletinib(SI=21.4)和Osimertinib(SI=40.9)比较，DY3002的选择性指数(SI=632)高出15-30倍。(2) DY3002对于携带突变型EGFR T790M的H1975细胞有强烈的抑制作用，IC50值为0.037μM，而对于携带野生型EGFRwild-type的细胞株A431，H1299，LOVO和A549的抑制作用很弱，IC50值分别为0.382μM、4.12μM、2.46μM和4.45μM。明显优于参比药物Rociletinib、Osimertinib和Gefitinib。对于携带敏感突变的HCC827(EGFR delE746_A750)，DY3002及参比药物都有很好的抑制作用。(3)AO/EB荧光双染法和DAPI染色法结果表明DY3002作用于EGFR野生株A431细胞和T790M突变株H1975细胞，均可引起细胞凋亡的形态学改变。同时DY3002对于H1975的诱导凋亡作用更显著。(4) DY3002对H1975细胞和A431细胞均可有效抑制活性氧片段ROS的产生，且呈剂量依赖性。但DY3002对于H1975的抗ROS作用更显著。(5)流式分析结果显示DY3002能使突变型H1975细胞的凋亡率明显增加(72.0％)并将细胞周期阻滞在G0/G1期，呈剂量依赖性，其作用优于Rociletinib(65.2％)和Gefitinib(4.6％)。对野生型A431细胞有一定的诱导凋亡作用，但DY3002和Rociletinib与Gefitinib比较，对野生型A431细胞的抑制作用较弱。说明DY3002有着很好的突变选择性。(6)细胞的迁移和侵袭实验表明DY3002能够强烈抑制A431细胞，但是对H1975细胞仅仅有轻微的抑制作用。与Rociletinib和Osimertinib比较，同样浓度下DY3002对A431细胞侵袭能力的抑制作用更强,但对H1975细胞的作用弱于Rociletinib和Osimertinib。(7)裸鼠皮下移植瘤实验验证DY3002的体内抗肿瘤活性，结果表明DY3002能抑制H1975细胞在体内的生长，给予10、20、50 mg/kg/day剂量的肿瘤抑制率(TGI)分别为38.97％、45.3％、64.6％，在50mg/kg/day组，DY3002抑制肿瘤的效果与Rociletinib相当，然而，DY3002的抑制效果远低于Osimertinib。此外，不同剂量处理组对小鼠体重几乎无影响，证明DY3002在体内毒性较小。DY3002能抑制肿瘤细胞生长，且呈现剂量依赖性。 观察DY3002对细胞毒性作用(1) DY3002对HBE细胞无明显抑制作用，IC50值大于40μM，明显弱于Osimertinib和Gefitinib。DY3002对肝细胞LO-2只有轻微的抑制作用，IC50值为4.24μM，表明DY3002对正常组织细胞毒性很低。(2)给予大鼠口服DY3002后，实验组与对照组比较，血糖无显著性差异。说明DY3002并没有引起健康大鼠血糖升高。 DY3002对NSCLC干预机制:(1)分子对接结果显示:DY3002能够与EGFRT790M激酶通过以下几种作用力捆绑结合。嘧啶环上的N-1位N原子通过氢键作用力与激酶上的Leu792氨基酸残基结合;丙烯酰基与Cys797共价结合;嘧啶环上C-5位的氯原子在空腔边缘与突变的Met790氨基酸残基结合，且与Met790距离为3.74(A)，提高了抗吉非替尼耐药活性;分子模拟结果合理的解释了DY3002的体外活性。(2)DY3002能够显著抑制EGFR下游AKT信号通路中相关蛋白的表达，随着给药浓度的依次增大，p-EGFR、p-AKT、p-ERK表达水平依次下调，呈现出剂量依赖性;对H1975细胞的抑制作用优于A431细胞。 结论: 1.新型化合物DY3002对突变型EGFR（EGFR L858R/T790M）有很好的抗肿瘤活性和突变选择性。2.DY3002对正常组织细胞毒性很低，且不引起健康大鼠血糖升高。3.DY3002能够与EGFRT790M激酶通过包括共价结合在内的几种作用力捆绑结合。4.DY3002是通过抑制EGFR信号通路中EGFR、AKT、ERK蛋白的活化发挥作用，从而诱导细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G0/G1期。