中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性,有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活,而且其酶促反应最适pH在7.0-7.5之间,可有效弥补酸性植酸酶的不足。本研究筛选了中性植酸酶产生菌,优化了其液态产酶参数,克隆与分析了其基因,在此基础上,构建了中性植酸酶原核和真核表达基因工程菌,旨在为中性植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下：1.中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及其液态产酶参数优化通过平板初筛和摇瓶复筛,从土壤中筛选出6株能够分泌中性植酸酶的菌株,其中菌株ZJ-6显示较高的活力。经鉴定表明,菌株ZJ-6为地衣芽孢杆菌,其液态发酵产酶培养基中最佳碳源为l%葡萄糖,氮源为0.1%硫酸铵,初始pH为7.5,最佳培养温度为55℃。经36h培养后,产酶水平达到最高,酶活为0.267U/ml,比活为0.701U/mmg。2.地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因克隆及序列分析通过PCR对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因(phyC)进行扩增,获得一段长约1.2kb的特异性产物,并将其克隆到pUCmT载体,构建含有目的基因片段的重组质粒pUCm-T phyC。序列分析表明,phyC基因全长1146bp,编码381个氨基酸,5’端有一段编码31个氨基酸的信号肽序列；不含有酸性植酸酶蛋白中均存在的高度保守的RHGXRXP和HD序列；与已报道的地衣芽孢杆菌(AY651979)、凝结芽孢杆菌(DQ346195)、枯草芽孢杆菌(AJ277890)、淀粉液化芽孢杆菌(AY836773)和芽孢杆菌sp.DSl1(BSU85968)中性植酸酶核苷酸同源性分别为99%、70%、67%、67%和67%,与所编码蛋白同源性分别为99%、69%、65%、65%和64%。该酶蛋白成熟肽二级结构中无规卷曲占57.42%,折叠占40.29%,α-螺旋占2.29%；其三级结构与模板蛋白lh61A(1.8A)同源性为68.2%。3.中性植酸酶基因工程菌株的构建将地衣芽孢杆菌ZJ-6编码的中性植酸酶基因(phyC)定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上,获得的重组质粒phyC-pET-30a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物(EPhyC5)经Ni-NTA亲和层析纯化后比活为2.87U／mg。SDS-PAGE表明,EPhyC5相对分子量为42.86 kDa。将地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因(phyCm)以N-端融合方式插入到酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列的3’端,构建重组质粒pPIC9K-phyCm,电击法转化毕赤氏酵母GS1 15。经MD／MM平板筛选、G418抗性筛选和酶活性测定,获得20个阳性表达子(pPhyCm),其中pPhyCm6活性最高。将pPhyCm6接种于BMMY培养基中,经0.5%甲醇诱导培养96h,发酵上清液中重组中性植酸酶(PPhyCm6)比活为8.64U／mmg。SDS-PAGE结果表明,PPhyCm6相对分子量为38.78kDa,与理论推算的分子量(38.7kDa)相吻合。在巴斯德毕赤氏酵母中实现了有生物学活性中性植酸酶的分泌表达。4.重组酶及其亲本酶的酶学性质分析野生酶PhyC最适温度和最适pH分别为55℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为57.36%；在pH6.5-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。EPhyC5最适温度和最适pH分别为60℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为68.26%；在pH6.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。PPhyCm6最适温度和最适pH分别为60℃和7.5；在80℃、pH7.5条件下处理2 min,残余酶活为59.42%；在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。重组酶EPhyC5和PPhyCm6在离子影响、底物特异性和Ca2+依赖性方面与亲本酶PhyC基本一致。EDTA、Cu2+、Cd2+、Ba2+和Mn2+对酶活性均有显著抑制作用；1.0mmol/LCa2+能提高酶蛋白的热稳定性和pH稳定性；植酸钠是特异性作用底物；氟化钠和钒酸铵均能引起酶活性降低。酶学性质