研究目的胃癌是全球致死率最高的恶性肿瘤之一,虽然近年来其发病率有所下降,但全球每年仍大约有930,000新确诊胃癌的病例,约有700,000例患者病人死亡,其中有2/3的病例发生在发展中国家,我国就占了42%。故胃癌的及时诊治显得尤为重要。目前胃癌诊断最有价值的方法是胃镜检查。但胃镜检查属侵入性检查,有一定的危险性且患者依从性和耐受性差,不适宜作为常规筛选检查。目前已发现的胃癌标记物如癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-9 (CA19-9)、糖链抗原125(CA125)、糖链抗原50(CA50)及糖链抗原CA72-4等指标诊断胃癌的敏感性、特异性均较低,用于术后复发的监测尚可,但用于临床诊断价值有限。近年来随着蛋白质组学研究手段的不断进步,越来越多的研究希望运用蛋白质组学手段寻找肿瘤标记物。本研究旨在运用SELDI蛋白芯片技术筛查胃癌血清特异蛋白波峰,并鉴定其中诊断价值较高的特异蛋白波峰,以期为将来采用血清学检查诊断胃癌提供新的标记物。研究方法一、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的筛选(一)运用弱阳离子SELDI蛋白芯片检测训练组,包括30例胃癌患者、16例良性慢性胃病患者(5例胃溃疡和11例慢性糜烂性胃炎伴肠化生)及30例健康对照人血清的蛋白波谱。同时采用放免法检测训练组被检者的CEA、CA199、CA125肿瘤标志物。(二)运用生物信息学技术采集和分析被检测标本有意义的波峰参数。(三)分别比较30例胃癌患者和16例慢性胃病患者(胃溃疡和慢性糜烂性胃炎)血清蛋白波峰差异、30例胃癌患者和30例对照血清蛋白波峰差异、30例胃癌患者和非胃癌患者46例对照血清蛋白波峰差异;以寻找鉴别胃癌价值较高的蛋白波峰;以上比较中共同的差异波峰为胃癌的特异性蛋白波峰;(四)绘制ROC曲线,并通过ROC曲线得到的临界值,评估胃癌特异性蛋白波峰对胃癌的诊断价值;并比较它们和已知肿瘤标志物诊断价值。(五)分析其中的特异蛋白波峰值和胃癌分期的相关性,分析特异性蛋白峰高低在与肿瘤胃癌有无淋巴转移间的差异相关性、分析特异性蛋白峰在早期胃癌(Ⅰ-Ⅱ)和晚期胃癌(Ⅲ-Ⅳ)的表达差异。二、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的验证(一)运用弱阳离子SELDI蛋白芯片盲法检测验证组10例胃癌患者、慢性胃病患者(慢性糜烂性胃炎伴肠化生)和10例正常健康对照血清蛋白波谱,采集第一步试验中胃癌特异性蛋白波峰的生物信息学数据;检测SELDI胃癌特异性蛋白波峰的重复性;(二)根据盲法验证的结果进一步确认胃癌特异性蛋白波峰的诊断价值。三、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的鉴定(一)将10位上一步SELDI特异蛋白波峰的筛选中发现质荷比5910蛋白波峰高表达的患者血清各100μl混为一份,运用弱阳离子Clinprot磁珠液体蛋白芯片技术检测质荷比为5910的特异蛋白波峰,并采用Clinprot磁珠液体蛋白芯片初步纯化富集质荷比为5910的蛋白。(二)将磁珠液体蛋白芯片富集液混合,室温旋转蒸干,进行一级LC-MS分离后,一级MS中选取最强的母离子进行MS/MS二级质谱鉴定,采用使用数据分析软件BioworksBrowser 3.3.1 SP1进行Sequest?检索,检索数据库为IPI Human(3.45),母离子误差设定为50ppm,碎片离子误差设为1Da,非酶切方式。四、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白验证通过比较自备的针对5910多肽段的多克隆抗体以及针对Fibrinogen alpha chain(即Fibrinopeptide A)的抗体进行免疫共沉淀,验证5910肽段以及辨别在胃癌患者血清中升高的是片段还是母蛋白。结果一、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的筛选(一)采用S/N大于5,出峰比例大于30%的峰为取峰条件,在运用弱阳离子SELDI蛋白芯片检测训练组(30例胃癌患者、16例良性慢性胃病患者和30例正常对照)中共检测到54个波峰;(二)通过单独比较30例胃癌患者和16例良性慢性胃病患者(胃溃疡和慢性糜烂性胃炎)血清蛋白波峰差异,发现66个峰在胃癌患者和慢性胃病患者之间存在统计学差异(P<0.05);比较30例胃癌患者和30例对照人血清蛋白波峰差异,发现15个峰在胃癌患者和正常对照人之间存在统计学差异(P <0.05);三组比较分析发现25个差异蛋白波峰(P <0.05);把良性慢性胃病和正常对照合为一组与胃癌组比较,发现之间存在19个差异蛋白波峰(P <0.05);较有意义的发现m/z为5910、5342、6439、3268、3476的五个蛋白波峰在四组分析中均有胃癌特异性差异;认为这5个差异蛋白波峰为诊断波峰;其中以5910蛋白波峰差异最显著;将良性慢性胃病和正常对照合为对照组,5910蛋白波峰诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.89,根据ROC曲线所得到的诊断临界值为17.3,采用本临界值诊断胃癌的灵敏度为83.8%,特异度为91.3%;采用5342蛋白波峰诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.85,根据ROC曲线所得到的诊断临界值为4.4,采用本临界值诊断胃癌的灵敏度为83.3%,特异度为82.6%;采用6439蛋白波峰诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.75,根据ROC曲线所得到的诊断临界值为8.5,采用本临界值诊断胃癌的灵敏度为73.3%,特异度为67.3%;采用3268蛋白波峰诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.74,根据ROC曲线所得到的诊断临界值为5.4,采用本临界值诊断胃癌的灵敏度为66.7%,特异度为73.9%;采用3476蛋白波峰诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.74,根据ROC曲线所得到的诊断临界值为2.5,采用本临界值诊断胃癌的灵敏度为96.7%,特异度为47.8%;(三)检测目前常用的胃癌血清学标志物发现其中CEA、CA125在胃癌中表达和良性慢性胃病中表达之间存在显著差异(P=0.03),在胃癌和正常对照中的表达间存在显著差异(P=0.04);把良性慢性胃病和正常对照合为一组与胃癌组比较,采用8为临界值,CEA诊断价值:灵敏度为20%,特异度为97.8%,ROC曲线下面积为0.52;CA199诊断价值:灵敏度为26.7,特异度为100%,ROC曲线下面积为0.57;CA125诊断价值:灵敏度为23.3%,特异度为100%,ROC曲线下面积为0.83。各肿瘤标志物区分早期胃癌和晚期胃癌:CEA,CA199在两组间无显著差异(P >0.05),CA125在两组间存在显著差异(P=0.02);各肿瘤标志物区分有无淋巴结转移:CEA,CA199在两组间无显著差异(P >0.05),CA125在两组间存在显著差异(P=0.01).(四)比较最有价值的蛋白质波峰5910蛋白与胃癌血清学标志物CEA的诊断价值时,发现5910的蛋白质波峰灵敏度优于CEA(P=0.00),其ROC曲线下面积优于CEA(P=0.00);对于CEA阴性的胃癌患者,5910波峰的诊断价值为83.3%。(五) 5910的蛋白波峰在早期胃癌和非早期胃癌表达间无显著差异(P=0.47),5910蛋白波峰和肿瘤有无淋巴结转移无关(P=0.97)。二、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的验证(一)运用弱阳离子SELDI蛋白芯片盲法检测验证组10例胃癌患者、5例慢性胃病患者(慢性糜烂性胃炎伴肠化生)及10例正常对照血清蛋白波谱,发现5910、5342和6439的蛋白波峰重现性较好。但诊断临界值有所变化,验证组中5910的诊断价值为:灵敏度为100%,特异度为93.3%。5910、5342、6439得到了和训练组一致的结果,而3268和3476未得到一致的结果,故3268和3476并非胃癌特异性蛋白波峰。三、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白波峰的鉴定(一)在Clinprot磁珠液体蛋白芯片重现了5910的蛋白波峰,在Clinprot上显示其质荷比为5905。(二)通过液相色谱鉴定发现5905蛋白质波峰的精确分子量为5910,质谱分析确定其氨基酸序列为“SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEG THSTKRGHAKSRPV”,通过搜库(NCBI blast)发现其为血纤维蛋白肽(Fibrinogen alpha chain,又名Fibrinopeptide A)C-末端的片断。四、SELDI-TOF-MS胃癌血清特异蛋白验证通过制备的抗体和免疫共沉淀结果进一步证实5910蛋白波峰为Fibrinogen alpha chain(即Fibrinopeptide A)的一个片断,而非Fibrinogen alpha chain(即Fibrinopeptide A)全序列蛋白。结论一、SELDI-TOF-MS是一种有效的寻找血清差异蛋白质波峰的手段,其筛选得到的差异蛋白质波峰可用于胃癌的诊断。二、SELDI-TOF-MS血清特异蛋白质波峰5910、5342及6437可能成为胃癌诊断的蛋白质波峰。尤其5910的蛋白质波峰,其诊断价值优于目前临床采用的肿瘤标志物(CEA、CA199、CA125);但本实验尚未进行5910的蛋白质波峰与肿瘤早晚期鉴别及肿瘤是否存在淋巴结转移的相关研究。三、在胃癌患者血清中特异性升高的5910的蛋白质经质谱鉴定为血纤维蛋白肽(Fibrinogen alpha chain,又名Fibrinopeptide A)C-末端片断,可能成为胃癌的血清特异性蛋白质分子标志物而应用于胃癌的血清学检测。