视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一类以进行性视网膜感光细胞凋亡为特征的致盲性疾病1。临床分为典型及非典型两类。在亚洲人中常见的RP类型为典型RP和非典型RP中的结晶样视网膜色素变性(Bietti’s crystalline dystrophy,BCD)2。尚无有效临床治疗方法。目前对RP治疗的研究热点包括基因治疗,营养因子补充、干细胞移植及视觉假体植入,其中外源性营养因子摄入,相对简捷、安全且可以和其他治疗方法联合应用,是可行性较强并具有较好研究前景的治疗方法。此外,临床研究需要靠灵敏的检测指标来评估疗效,但目前对BCD的研究多限于基因突变的筛选以及临床表现的个案报道。缺乏对BCD疾病进展程度,特别是视觉功能损害程度的客观评价标准。神经生长因子(NGF)是神经营养因子家族中研究最为透彻的一种神经细胞生长调节因子。研究表明NGF的减少或缺乏与RP疾病的发生发展存在重要的关系3-5。眼局部补充外源性NGF能够明显延缓视网膜色素变性动物模型中感光细胞的变性5。从小鼠颌下腺提取的NGF的肌肉注射剂型作为国家准字号药物进入临床应用为NGF治疗视网膜变性疾病带来了契机。但由于全身给药非目标性及达眼部药物浓度的有限性,使其应用受到一定限制。以往对研究者多采用球周注射NGF来研究其对RP的治疗作用,需要较高的药物浓度及频繁的重复注射。玻璃体腔注射技术具有眼内直接给药的优势,但玻璃体腔注射NGF在眼内各组织特别是视网膜的药物分布情况尚未见报道。研究证明玻璃体腔注射NGF能够延缓缺血、视网膜脱离等导致的继发性视网膜变性6,7,但并没有报道玻璃体腔注射NGF对所研究动物模型的眼部安全性。而且尚无玻璃体腔注射NGF治疗RP的基础研究报道。本实验室前期工作证实了20ug/0.1mlNGF进行玻璃体腔注射对家兔及晚期典型RP患者的安全性,但单次注射NGF对晚期RP患者并没有明显的有效性。其原因可能是药物含量低,注射频率少,纳入晚期RP病人视网膜损害严重。因此本研究需要进一步增加NGF药物剂量,探索重复注射NGF策略,扩大纳入RP受试者的分期及分类范围,来深入进行玻璃体腔注射NGF的临床前研究。临床研究需要依靠灵敏的检测指标来进行疗效的评估,但目前对BCD的研究多限于基因突变的筛选以及临床表现的个案报道。缺乏对BCD疾病进展程度,特别是视觉功能损害程度的客观评价标准。因此明确临床视觉功能检查手段如视力、视野、电生理检查等对各临床分期BCD视网膜功能评价的作用是进行治疗学研究的前提。瞳孔光反射(PLR)是一种对视觉反应的重要客观检查手段8, 9。刘勇博士前期研究中证实特定光刺激下瞳孔收缩强度能够客观、灵敏反应典型RP感光细胞功能。但瞳孔收缩强度能否客观量化评估包括晚期在内的BCD病人感光细胞功能,尚未见系统研究。因此本研究拟应用较高剂量NGF,通过动物试验明确玻璃体腔注射NGF后眼内药物含量分布、药物对眼部安全性及对RCS大鼠有效性,进而评估单次和重复玻璃体腔注射NGF治疗典型RP及BCD受试者的安全性,在此基础上进行玻璃体腔注射NGF对RP受试者有效性的研究,为RP的治疗探索新的药物及使用方法。本试验方案获第三军医大学西南医院医学伦理委员会通过(审批号:KY2008001),并在世界卫生组织临床试验注册分部中国临床试验注册中心成功注册,(注册号:ChiCTR-TRC-00000411)。试验内容和研究结果如下:1动物研究部分:1)采用同位素示踪法对比研究家兔玻璃体腔注射和球周注射125I-NGF眼部各组织药物分布情况,结果发现玻璃体腔注射NGF较球周注射能够在眼内各组织达到高的药物浓度。玻璃体腔注射125I-NGF后,眼部各组织125I-NGF含量分布为玻璃体(471.75±4.42)>视网膜(118.32±18.74)>脉络膜(79.13±8.82)>虹膜睫状体(68.29±14.41)>房水(51.42±7.28)>巩膜(36.64±4.16)>角膜(21.00±3.10)。2)进行兔眼玻璃体腔注射NGF的眼部安全性评估。结果发现不同时间点观察其角膜、晶体、玻璃体、视网膜均未见明显异常,1m时行组织病理检查视网膜各层结构未见异常。3)采用DAPI染色视网膜外核层厚度测量以及TUNEL试验检测视网膜外核层感光细胞凋亡指数的方法评估P30d RCS大鼠重复玻璃体腔注射NGF的有效性。结果显示在P45d,P60d,P90d时,重复玻璃体腔注射NGF组其视网膜外核层厚度厚于生理盐水注射组及空白对照组(p<0.05);NGF治疗组视网膜感光细胞凋亡指数低于生理盐水注射组及空白对照组(p<0.05)。2、进行了单次玻璃体腔注射NGF对20例典型RP及15例BCD安全性的临床前试验。发现NGF治疗后1d、7d、1m时BCD主观感觉好于典型RP。典型RP治疗后眼部炎症反应明显,1d时评分大于3分占30%,7d时占10%,1m炎症消失;BCD治疗后眼部炎症反应轻,1d时评分大于3分占10%,7d时炎症已经消失。长期观察(12m)典型RP及BCD眼部B超、眼底及OCT未见明显异常。不良反应发生率:典型RP为20%,BCD为0。基于此结果进一步进行了重复玻璃体腔注射NGF对BCD安全性的临床前试验,对每3月重复注射NGF及每1月重复注射NGF的安全性进行比较。发现两组BCD受试者均主观感觉良好,眼部炎症反应轻,无炎症叠加现象,长期观察两组BCD OCT均未见明显异常。3、通过眼底分期及视觉功能检测对15例BCD受试者病情进展程度进行治疗前评估,同时筛选对BCD有效的视觉功能检测指标。1例早期BCD 85°视野检查为1级、fERG五项检查为B级,mERG已显示出明显异常。8例中期BCD fERG、85°视野检查存在多个分级阶段的异常程度。mERG为熄灭型。6例晚期BCD85°视野尚可定位残存视敏度较弱的视岛,但fERG、mERG均为熄灭型。采用自主研制的全视野光刺激瞳孔记录仪对BCD受试者进行PLR检测,发现BCD受试者瞳孔收缩强度均普遍低于正常人,且随BCD分期进展,瞳孔收缩强度降低。低亮度蓝光刺激下,瞳孔收缩强度随病情分期变化明显,中等亮度白光刺激下瞳孔收缩强度与fERG max-b波振幅呈正相关。提示暗适应全视野刺激下的瞳孔收缩强度可以作为BCD患者感光细胞功能的客观量化指标。4.对15例BCD受试者进行了每1月及每3月重复玻璃体腔注射NGF疗效对比的临床前试验。结果表明:经玻璃体腔注射后1月受试者视力,视野,蓝光、白光刺激下瞳孔收缩强度均有所提高。经重复玻璃体腔注射NGF后,每1月重复治疗组视力,视野,蓝光、白光刺激下瞳孔收缩强度均能够维持首次治疗后的视觉改善状态,而每3月重复治疗组则有所波动,在每次治疗后3月时有回复的趋势。停药后两组视功能均有回退的倾向。综上所述,本研究得到如下结论:1、玻璃体腔注射NGF在兔眼各组织内特别是视网膜组织可达到高药物含量,这一治疗方法对兔眼是安全的,证明了玻璃体腔注射NGF是一种理想的治疗眼底疾病方法。2、重复玻璃体腔注射NGF能延缓RCS大鼠ONL层变性,为NGF治疗RP的临床研究提供了重要的基础试验依据。3、通过临床研究证实了玻璃体腔注射NGF对BCD的安全性,而对tRP具有致炎作用。4、对各期BCD视觉功能检测进行系统分析,发现功能检测比眼底形态学检测更能灵敏评估病损程度,不同分期BCD其有效功能检测指标不同,为BCD治疗学研究筛选了疗效检测手段5、进行了BCD治疗学探索,发现重复玻璃体腔注射NGF能够改善BCD视觉功能,每1月重复治疗较每3月重复治疗的方案能够更好的维持其视觉功能的改善。