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肠道是哺乳动物主要的消化和营养物质吸收器官。肠道上皮具有快速自我更新的特征,而位于隐窝基部的肠道干细胞则是上皮细胞更新的动力源泉,因此肠道成为研究成体干细胞的理想模型之一。小肠干细胞通过快速的自我更新与分化保证了营养物质的正常吸收,同时在肠上皮损伤情况下也能够使损伤的上皮得到快速修复,而肠道干细胞的异常活化也是引发结直肠癌的重要因素。因此,研究肠道干细胞自我更新、增殖的分子机制对深入认识肠道上皮的稳态平衡、肠上皮损伤后修复和肠道肿瘤发生的机理具有重要的科学意义和潜在应用价值。肠道干细胞包含位于隐窝基底部的Lgr5+活跃态干细胞和位于+4位置的Hopx+静息态干细胞。肠道干细胞的自我更新及增殖受多种因素的调控,其中miRNAs(miRNAs)是一类20-24个核苷酸大小的非编码RNA,通过与靶基因的3’-UTR 区结合从而抑制靶基因的转录或翻译。MiRNA-31(miR-31)作为非编码RNA中的一员,在包括肌肉、间充质干细胞等多种成体干细胞的命运决定和状态维持以及肿瘤发生中均发挥重要调节作用,尤其在大部分肠炎及结肠癌患者中miR-31的表达异常高于正常组织。但是,目前关于miR-31与肠道干细胞的研究仍未见报道。因此,本课题旨在研究和探讨miR-31在肠道干细胞、肠上皮损伤修复和肠道肿瘤发生发展中的功能和作用机制。本研究首先利用 Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2和HOPX-CreERT2;Rosa26mTmG转基因小鼠,通过流式分选和qRT-PCR技术发现,miR-31在Lgr5+干细胞和+4位置Hopx+静息态干细胞中的表达相对较高。与正常肠道组织相比,12 Gy电离辐照处理和葡萄糖硫酸钠(DSS)诱导均能导致miR-31的表达水平显著上调。这些结果预示miR-31可能参与肠道干细胞的维持及肠道损伤修复过程。为了进一步研究miR-31的功能,本课题利用Tet-On、Cre-loxP系统及Case9技术分别构建了 Dox(Doxycycline)可诱导的 全身过表达小鼠(TRE-miR31)、miR-31全身敲除小鼠miR-31-/-及肠道上皮特异性敲除miR-31的条件敲除小鼠Vilin-Cre;miR-31fl/fl(cKO)。过表达miR-31引起小肠隐窝高度增加,增殖细胞数量增多,Lgr5+干细胞比例上调,数量显著增多。而全身敲除和条件性敲除miR-31后的小鼠表型与之相反,表现为细胞增殖受到抑制,Lgr5+干细胞数量减少,隐窝基部凋亡的Lgr5+细胞增多,表明在稳态情况下miR-31可以促进活跃态干细胞的增殖。当小肠受到电离辐照损伤后,miR-31过表达抑制隐窝基部Lgr5+干细胞的凋亡、促进新生隐窝的再生和增殖,加快损伤上皮的修复过程,显示其具有抗辐射的功能。同样在DSS诱导的肠炎模型中,miR-31能够减缓炎症造成的小鼠体重下降和生存率降低,同时加快损伤肠道的修复过程。这些结果表明当肠道处于压力条件下,miR-31在肠道上皮的损伤修复过程中发挥重要作用。在肠道肿瘤模型相关研究中,异种移植结果显示miR-31能够促进人结肠癌细胞(HCT116)成瘤生长;AOM/DSS诱导的结肠肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠结肠远端肿瘤数量减少,体积减小;Villin-Cre;APC+/fl的肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠小肠肿瘤的数量和体积也明显下降,这些结果表明在肠道中,miR-31作为促癌因子能够促进肿瘤的生长,从而使其可能成为治疗肠道肿瘤的潜在靶点。在分子机制上,通过双荧光素酶活性检测和CLIP-qPCR等实验证实miR-31通过直接靶向结合Dkk1、Axin1、Gsk3β而激活Wnt信号通路,同时通过靶向结合Smad3、Bmpr1a和Smad4抑制BMP/TGFβ信号通路活性,从而促进活跃态干细胞的增殖、静息态干细胞的激活和肿瘤的发展过程。而且.,本研究还发现miR-31能够通过调控Gsk3β和p38抑制干细胞细胞的凋亡过程。在miR-31上游调控机制上,辐照和DSS诱导激活了 STAT3和NF-tκB信号通路。ChIP-qPCR结果进一步证实p-Stat3和p65能够与miR-31的启动子区直接结合从而上调miR-31的表达。综上所述,本研究主要发现包括:1)发现miR-31是内源性的小肠干细胞激活信号,通过激活Wnt和抑制BMP/TGFβ促进干细胞增殖,通过抑制Gsk3β和p38保护小肠干细胞免于凋亡。2)在小肠上皮再生过程中,miR-31首先保护小肠干细胞免于凋亡,然后通过抑制BMP/TGFβ、激活Wnt信号促进存活的小肠干细胞进行快速增殖。3)鉴定出miR-31作为促癌基因,通过Stat3-miR-31-Wnt/BMP/TGFβ信号通路促进结肠癌发生发展。4)首次阐明了某种特异miRNA在小肠干细胞中的生理功能。因此,本研究表明miR-31是小肠干细胞的一个主要调节因子,同时也是肠道上皮再生紊乱、肿瘤等多种肠道疾病治疗的潜在靶标。