高级别脑胶质瘤是成年人致死率最高的肿瘤之一,它给临床治疗带来巨大挑战。术后积极采用放疗与替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)同步放化疗加辅助性TMZ化疗的治疗策略,可使恶性程度最高的脑胶质瘤,多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)患者的中位生存期从12.1个月提高到14.6个月。然而由于肿瘤细胞对TMZ固有或治疗诱导的耐受,该治疗方案的整体临床疗效仍然令人失望。因此,十分有必要对该致命肿瘤的进展、耐药机制及相关新的治疗靶点进行更全面更深入的了解。叉头盒状转录因子1(Forkhead box M1,FOXM1)在各种人类癌症组织中表达上调,并且几乎参与了肿瘤的所有恶性特征。也有研究发现FOXM1在脑胶质瘤表达上调且可能促进了胶质瘤干细胞(Glioma stem cell,GSC)的维持和对TMZ的耐受。因此,很有必要对FOXM1在脑胶质瘤生长和耐药中的作用和具体分子机制,以及以FOXM1为靶点的新疗法进行更加深入和系统的研究。1.FOXM1在脑胶质瘤生长和TMZ耐药中的作用1.1利用公共数据库分析FOXM1在脑胶质瘤的表达及生物学功能。借助于一些数据处理工具,我们首先利用数据库TCGA(The Cancer Genome Atlas)、CGGA(Chinese Glioma Genome Atlas)和RAMBRANDT(Cancer Institute Repository for Molecular Brain Neoplasia Data)分析了FOXM1在脑胶质瘤中的mRNA表达。在所有三个数据库中,FOXM1 mRNA水平在胶质瘤样本中均上调,并随着胶质瘤分级的增加而升高。Kaplan-Meier生存分析显示,以所有脑胶质瘤患者或较低级别脑胶质瘤(Lower grade glioma,LGG)患者为研究对象时,FOXM1 mRNA水平与总生存时间(Overall survival,OS)呈负相关。通过cBioPortal for Cancer Genomics数据平台,我们从TCGA中选择了与FOXM1在LGG或GBM或两者中表达正相关的基因。通过FunRich12.0对LGG和GBM中与FOXM1正相关的基因进行了细胞定位和生物学功能分析。1.2 FOXM1促进脑胶质瘤生长。我们通过慢病毒转染建立了FOXM1过表达的U251和U87细胞系。RT-qPCR、western blot和免疫细胞荧光法(Immunocytofluroscence,ICC)验证了其过表达效果。相反,我们也通过转染siRNA来敲低LN229细胞中FOXM1的表达。MTT法显示,与对照组相比,FOXM1过表达细胞的光密度值(Optical density,OD)值明显升高,而FOXM1基因敲低细胞的OD值明显降低。Edu-594细胞增殖实验也表明,FOXM1的过表达促进了胶质瘤细胞的增殖,而FOXM1的敲低抑制了胶质瘤细胞的增殖。此外,FOXM1的过表达也促进了细胞克隆的形成和细胞球的生长,而FOXM1的敲低则会抑制细胞克隆的形成和细胞球的生长。为了证实这些体外实验结果,我们进一步在小鼠体内建立了胶质瘤模型。在裸鼠皮下模型中,FOXM1过表达组的肿瘤体积和重量明显高于对照组;在NOD-SCID小鼠原位模型中,FOXM1过表达U87细胞的肿瘤表面积远大于对照细胞。这些结果表明FOXM1在胶质瘤细胞增殖和致瘤性中起重要作用。1.3 FOXM1增强脑胶质瘤对TMZ的耐受。MTT法检测结果显示,FOXM1过表达的U251和U87细胞对TMZ的敏感性低于对照细胞,而FOXM1基因敲低的LN229细胞对TMZ的敏感性高于对照细胞。用γ-H2AX标记TMZ处理后的DNA双链断裂,ICC显示FOXM1过表达组的γ-H2AX表达较对照组少,而siRNA转染组的γ-H2AX染色较对照组强。流式细胞术实验还表明,FOXM1过表达减弱、FOXM1基因敲低增强了TMZ的凋亡诱导作用。进一步在裸鼠皮下移植的异种移植模型中检测了FOXM1过表达对TMZ的影响。在相同剂量TMZ处理下,FOXM1过表达细胞的肿瘤体积和重量明显高于来源于对照细胞的肿瘤。2.FOXM1调控Survivin的转录表达2.1 Survivin与FOXM1表达水平正相关。通过生物信息学分析TCGA、CGGA和RAMBRANDT的脑胶质瘤数据,我们发现Survivin在胶质瘤组织中表达显著上调,在越高级别胶质瘤中表达水平越高。Kaplan-Meier法生存分析显示,三个数据库中Survivin mRNA的表达与患者OS呈负相关。Pearson相关分析显示Survivin mRNA表达水平与FOXM1 mRNA表达水平呈正相关。特别是在TCGA的胶质瘤数据中,Survivin在LGG和GBM中均显著上调,且与LGG和GBM中FOXM1的表达均呈正相关。Heatmap聚类分析表明,在抗凋亡蛋白家族的所有典型成员中,Survivin与FOXM1的表达关系最为密切。用RT-qPCR法检测了6株胶质瘤细胞系中FOXM1和Survivin的mRNA水平,发现它们之间存在显著的相关性。2.2 FOXM1直接调控Survivin的转录表达。RT-qPCR和western-blot结果显示,Survivin在FOXM1过表达U251和U87细胞中表达上调,在siRNA转染的LN229细胞中表达下调。ICC染色也得到了类似的结果。为了确定Survivin基因(BIRC5)是否是FOXM1的直接靶点,我们通过在线软件LASAGNA-Search 2.0初步获得了BIRC5启动子上FOXM1最可能的结合序列。荧光素酶报告基因实验表明,在FOXM1过表达细胞系转染含有野生型启动子序列的报告质粒时,报告质粒的荧光素酶活性最高,而转染了含有突变型启动子序列的报告质粒的FOXM1过表达细胞系和对照细胞系具有最低的荧光素酶活性。然后我们检测了Survivin在FOXM1诱导TMZ耐药中的作用。MTT法检测Survivin基因敲低减弱了对照细胞和FOXM1过表达细胞对TMZ的抗性。集落形成实验表明,Survivin抑制剂YM155显著降低了FOXM1过表达细胞的克隆形成能力。RT-qPCR、western-blot和ICC实验表明,在TMZ耐药的胶质瘤细胞株中,FOXM1和Survivin的表达明显上调。2.3 FOXM1-Survivin轴在胶质瘤临床标本中表达上调,且与不良预后相关。通过RT-qPCR和IHC检测临床胶质瘤组织中FOXM1和Survivin的mRNA和蛋白表达。我们发现,大多数胶质瘤标本中,FOXM1和Survivin的mRNA和蛋白水平均上调,且FOXM1与Survivin的mRNA表达和蛋白表达均呈显著正相关。Kaplan-Meier法生存分析进一步揭示了FOXM1和Survivin蛋白表达在胶质瘤患者和LGG患者中的预后预测作用,但在GBM患者中没有显著相关性。SPSS17.0中的卡方检验表明,FOXM1/Survivin蛋白表达与Karnofsky评分(KPS)、WHO分级和复发(间隔)时间显著相关。Cox比例风险模型的单变量和多变量分析均表明,FOXM1表达水平和Survivin表达水平是影响患者预后的重要危险因素。3.蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)通过下调FOXM1-Survivin轴降低脑胶质瘤生长和TMZ耐受3.1 Bortezomib下调FOXM1-Survivin轴。RT-qPCR和western blot结果显示,10nM和20nM Bortezomib作用48h后,U251和U87细胞中FOXM1和Survivin的mRNA和蛋白水平显著降低,ICC实验进一步证实了上述结果,治疗组FOXM1/Survivin的荧光强度明显低于对照组。IHC法检测裸鼠皮下胶质瘤模型中FOXM1/Survivin的蛋白表达,发现Bortezomib组和Bortezomib+TMZ组FOXM1和Survivin的表达强度明显低于对照组,而TMZ组的FOXM1和Survivin表达强度明显高于对照组。3.2 Bortezomib抑制胶质瘤细胞增殖。MTT实验表明Bortezomib对U251和U87细胞株生长增殖的抑制作用具有剂量和时间依赖性。Bortezomib对U251和U87细胞的最小有效浓度分别为10nM和5nM,Bortezomib在第4天的IC50大于在第2天的值。流式细胞术检测发现,10nM和20nM Bortezomib明显诱导胶质瘤细胞凋亡,其中早期和晚期细胞凋亡均显著增加;流式细胞术检测发现Bortezomib诱导胶质瘤细胞出现周期阻滞,且类似于G1期阻滞。10nM和20nM Bortezomib对肿瘤细胞球形生长和集落形成也有明显的抑制作用。经10nM和20nM Bortezomib或药物溶剂预处理后,将胶质瘤细胞移植到干细胞培养基中,发现Bortezomib预处理的U251和U87细胞的干细胞集落/悬浮球显著少于相应对照组。3.3 Bortezomib减弱TMZ耐受。MTT实验结果显示,10nM Bortezomib与200μM TMZ联合组的细胞存活率显著低于单独应用Bortezomib或TMZ的组。与MTT实验结果相一致,Bortezomib与TMZ联合应用使胶质瘤细胞球生长速度和细胞球表面积明显减小。流式细胞术实验还表明,Bortezomib和TMZ联合应用对U251和U87细胞的凋亡诱导和G1期阻滞作用明显强于单独应用Bortezomib和TMZ。在裸鼠皮下建立的异种胶质瘤模型中,Bortezomib和TMZ联合组的肿瘤生长率(肿瘤体积)和最终肿瘤重量均明显低于Bortezomib组和TMZ组。在NOD-SCID小鼠颅内原位胶质瘤模型中,通过苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色水平切片来测量最终肿瘤大小,发现联合组的平均肿瘤表面积远远小于Bortezomib组和TMZ组。4.FOXM1-Survivin轴与NF-κB通路的相互作用4.1 NF-κB调控Survivin表达。RT-qPCR和western blot结果显示,经NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)处理后,FOXM1的mRNA和蛋白水平没有明显改变。通过ICC实验,我们同时发现Bortezomib对NF-κB在细胞核的表达无明显影响,因此Bortezomib以一种独立于NF-κB的方式下调了FOXM1-Survivin轴。PDTC可明显降低Survivin、BCL-XL和MGMT的表达。相反,TMZ可显著增加Survivin、BCL-XL和O6-甲基鸟嘌-DNA-甲基转移酶(O~6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)的表达,同时PDTC可抑制TMZ刺激的BCL-XL和MGMT的过度表达,但不能抑制Survivin的表达。这表明TMZ还通过其他NF-κB非依赖性途径刺激Survivin的表达,如FOXM1。4.2 NF-κB抑制剂PDTC提高U251细胞对TMZ的敏感性。为了探讨Bortezomib、TMZ和PDTC联合应用的可能性,我们初步观察了PDTC单独或与TMZ联合对U251细胞的化疗效果。MTT实验表明PDTC对U251细胞活力的抑制作用呈剂量和时间依赖性。PDTC和TMZ联合组比PDTC组和TMZ组有更高的细胞活性抑制率。流式细胞术实验也显示PDTC剂量依赖性诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。即使低至20nM,PDTC联合TMZ也能显著增强TMZ的凋亡诱导和周期阻滞作用。综上所述,我们的研究表明FOXM1增强了脑胶质瘤的进展和TMZ耐受;经典的抗凋亡蛋白Survivin是FOXM1的直接靶点;在脑胶质瘤中,FOXM1-Survivin轴明显上调且与胶质瘤患者不良预后相关。我们进一步发现,蛋白酶体抑制剂Bortezomib特异下调FOXM1-Survivin轴,从而降低脑胶质瘤体外和体内的生长和对TMZ的耐受。Survivin而非FOXM1的表达受NF-κB调控;NF-κB抑制剂PDTC能增强TMZ的化疗敏感性。