实验目的:　　氧化石墨烯(GO)作为石墨烯最常见的衍生物之一，凭借其良好的导电性、导热性、极大的比表面积、光学性能和机械性能等优良的特性而被广泛应用于药物载体、DNA发送装置、生物成像技术、生物传感器等。目前GO生物相容性的研究还处在细胞水平，关于GO是否引起细胞基因毒性的详细研究还鲜有报道。一方面，人眼作为人体的特殊器官，由于具有血眼屏障导致很多药物无法通过，使得眼部疾病的药物治疗显得尤为困难。有研究表明GO能够自由穿透视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞，血眼屏障的主要组成)，因而GO在眼部疾病治疗领域具有很大的应用潜力。有研究报道GO导致ARPE-19细胞的死亡率极低，具有较好的生物相容性，同时，也有研究发现GO表面含氧官能团能够影响其生物相容性。本研究首先制备还原型氧化石墨烯(RGO)，之后深入研究和探讨GO及RGO对ARPE-19细胞的潜在基因毒性，对比分析GO表面含氧官能团对ARPE-19细胞的潜在基因毒性的影响。本实验第一步从细胞水平评价GO及RGO对ARPE-19细胞的毒性;第二步分别从基因组水平和表达水平分析GO和RGO是否引起ARPE-19细胞的DNA损伤及损伤修复途径;最后检测在GO和RGO刺激下，ARPE-19细胞胞内活性氧浓度变化，揭示GO和RGO对ARPE-19细胞产生DNA损伤的机理。以上实验进一步研究了GO在人眼部的生物相容性，为人眼部疾病的诊断和治疗奠定基础。　　实验方法:　　一制备还原型GO(reduced graphene oxide RGOs)　　GO和柠檬酸钠按1/50的质量比配成分散液，利用反应釜在100℃形成高温高压的环境，控制还原时间分别为3、6、9和12小时制备不同还原程度的RGOs（分别命名为RGO-3、RGO-6、RGO-9和RGO-12）。　　二 GO和RGOs在水溶液中的颜色和分散性　　将GO和RGOs通过静置不同的时间来判断其在水溶液中的颜色及分散性，选择最佳还原时间的RGOs。　　三 GO和RGOs的表征　　将RGOs进行一系列的表征，包括紫外-可见分光光谱图(UV)、傅立叶红外光谱图(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)从而证明得到不同还原程度的RGOs。　　四 GO和RGOs细胞水平毒性的评价　　通过CCK-8方法测量不同浓度的GO及RGOs材料在不同刺激时间的情况下ARPE-19细胞的存活率，对比RGOs和GO材料在细胞水平的毒性大小。　　五 GO和RGOs基因水平毒性的评价　　通过单细胞凝胶电泳实验、蛋白印迹方法检测不同浓度的RGOs及GO对ARPE-19细胞刺激不同时间引起的DNA损伤程度和DNA修复蛋白磷酸化P53蛋白的表达量，分析两种材料的基因毒性大小。同时检测在不同浓度GO和RGOs材料刺激不同时间的情况下，ARPE-19细胞胞内活性氧浓度变化，揭示GO对ARPE-19细胞产生DNA损伤的机理。同时，对比分析GO表面含氧官能团对ARPE-19细胞的生物毒性的影响。　　实验结果:　　一从GO和RGOs材料的颜色上来看，GO为黄褐色，RGOs变为黑色，RGOs材料的分散性也随着其还原时间和静置时间的延长而变差。　　二从UV-vis图谱、FTIR图谱和XPS能谱等表征结果看出不同还原程度的RGOs材料被成功制备。　　三从ARPE-19细胞存活率的柱状图看出，GO具有较好的细胞相容性;RGOs对ARPE-19细胞具有较高的细胞致死率。因此RGOs对ARPE-19细胞的细胞毒性明显大于GO。　　四从单细胞凝胶电泳实验和蛋白印迹结果分析，GO在低浓度时几乎不引起ARPE-19细胞DNA损伤，而高浓度GO和低浓度RGOs都能引起DNA损伤，说明RGOs的基因毒性要大于GO。细胞内活性氧的结果与上述结果一致，因此我们推测RGOs能够引起ROS-依赖型的基因损伤。　　实验结论:　　本研究首先选用“绿色”还原剂柠檬酸钠还原GO，通过控制还原时间制备不同还原程度的RGOs。通过对比分析细胞水平的研究发现GO对ARPE-19细胞具有较好的生物相容性，而RGOs对ARPE-19细胞具有较高致死率。基因水平的研究发现GO在低浓度对ARPE-19细胞是安全的，高浓度时有一定的基因毒性，而RGOs在低浓度时已对ARPE-19细胞产生了一定的基因毒性。由此说明RGOs对ARPE-19细胞的毒性明显大于GO，推测GO表面含氧官能团可能一定程度的减少其生物毒性。此外RGOs引起细胞基因损伤的原因可能是细胞内活性氧的增高。