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背景随着肿瘤研究水平的不断发展,生理条件下肿瘤细胞生物学行为的分析及在体肿瘤的可视化识别,成为提高肿瘤诊治水平的关键,但是这些研究的实现需要依托更为有效的研究技术和实验方法。而量子点(quantum dots, QDs)这种具有独特荧光特性纳米半导体材料的出现,为肿瘤在体方面的研究提供了一种有效的研究方法。然而,这种新型的纳米荧光材料尚未得到广泛的认可,其标记的敏感性、稳定性及生物学毒性是否满足生物医学的要求需要进行探讨。本文通过该标记技术对泌尿生殖系肿瘤组织标本和细胞进行荧光标记,初步认识了量子点荧光标记技术的相关应用特点,并对该技术在生物医学领域中实际应用进行了可行性分析。目的一方面,比较量子点荧光标记技术与免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)对膀胱癌(bladder cancer, BC)组织标本中CD44v6抗原和前列腺癌(prostate cancer, PCa)组织标本中前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)的检测,观察该标记技术的敏感性和稳定性；另一方面,评估该技术对膀胱肿瘤EJ细胞和前列腺癌PC-3细胞活性的影响,并通过对细胞的量子点荧光标记初步探讨该技术在生物医学领域的实际应用价值。方法分别对80例膀胱癌组织标本中的CD44v6抗原和40例前列腺癌组织标本中的PSCA抗原的表达进行量子点荧光标记和IHC染色,在显微镜下,根据标记的密度和强度对结果进行分级,再结合肿瘤的分期和分级对两种标记方法的结果进行比较,同时对量子点荧光标记后阳性表达的荧光衰减过程进行观察。之后,还进行量子点对膀胱癌EJ细胞和前列腺癌PC-3细胞的毒性检测,并分别用量子点荧光特异性和非特异性标记对活体细胞进行标记,观察其标记效果。此外,还利用量子点的特独荧光特性对组织标本和固定细胞进行了量子点荧光双色标记。结果1.量子点荧光标记和IHC染色对膀胱癌组织标本CD44v6的检测结果两种标记方法均显示,CD44v6抗原在膀胱尿路上皮癌组织中的表达与肿瘤的分级(QDs,r=-0.345,P=0.002；IHC,r=-0.392,P<0.001)和分期(QDs,r=-0.243,P=0.03；IHC,r=-0.306,P=0.006)呈负性相关,并且两种方法的Kappa分析值为0.931(P<0.001),说明两种标记方法对膀胱尿路上皮癌组织标本中CD44v6抗原的检测具有一致性。2.量子点荧光标记和IHC染色对前列腺癌组织标本PSCA的检测结果两种标记方法均显示,PSCA抗原在前列腺癌组织中的表达与肿瘤的Gleason评分(QDs,r=0.732,P<0.001；IHC,r=0.683,P<0.001)和分期(QDs,r=0.514, P=0.001; IHC, r=0.432, P=0.005)呈正性相关,并且两种方法的Kappa分析值为0.874(P<0.001),说明两种标记方法对前列腺癌组织标本中PSCA抗原的检测具有一致性。3.量子点荧光标记后阳性荧光的持久性观察对全部90例(CD44v6,51例；PSCA,39例)阳性表达的组织标本选取同一视野在标记后的第10、20和30天分别进行观察,发现和标记当天的结果相比,标记后第10天的荧光强度未出现显著的变化(P=0.157),仅有2例中度表达衰变为低表达；标记后第20天的荧光强度开始出现具有统计学差异的改变(P<0.001),有22.6%(7/31)的标本由高表达衰变为中度表达,有23.7%(9/38)的标本由中度表达衰变为低表达；标记后第30天,有11例高表达的荧光未判读改变,但整体荧光强度变化更为明显(P<0.001),绝大多数的阳性荧光强度保持在中度和低表达水平,有3例低表达的标本荧光发生泯灭,但依然有96.7%(87/90)的组织标本荧光清晰可辨。4.量子点对活体膀胱癌EJ细胞和前列腺癌PC-3细胞的毒性检测通过CCK-8检测发现,两种活体细胞和量子点共同孵育24h后,其存活率随着量子点浓度的升高均显示下降趋势,在日常使用浓度(5nM、10nM和20nM)下,两种细胞的存活率和对照组相比没有统计学差异(P均>0.05),在80nM高浓度时虽然差异明显(P<0.001),但是两种细胞的平均存活率也高达92.6%(EJ细胞)和95.8%(PC-3细胞)。5.活体细胞量子点荧光特异性和非特异性标记的结果对膀胱癌EJ细胞上的CD44v6抗原进行特异性标记,发现CD44v6抗原在膀胱癌EJ细胞膜表面有清晰的荧光表达,该技术具有较好的敏感性,但是对标记了荧光量子点的细胞在常规培养环境下继续进行观察,荧光仅能维持6-12h即发生泯灭；通过利用Tat多肽的转导作用对前列腺癌PC-3细胞进行非特异性标记,发现该方法虽不具备靶向标记作用,但是荧光量子点在细胞内保持着良好的稳定性,实验一周后量子点荧光的强度没有发生明显变化,此外在观察期间,还通过该方法成功对细胞的分裂过程进行了荧光示踪。6.对组织标本和固定细胞的量子点荧光双色标记分别对膀胱癌组织标本和EJ固定细胞的CD44v6和PCNA抗原进行量子点荧光双色标记,均能清楚的显示出两种抗原在细胞不同位置的表达,CD44v6抗原定位于细胞膜表面,PCNA抗原则在细胞核表达。结论量子点荧光标记技术不仅具有良好的敏感性和稳定性,而且在对活体细胞的应用中不影响其生物活性。文中通过对组织标本和活体细胞的标记研究,显示了该技术在泌尿生殖系肿瘤研究领域的广阔前景,这些将为提高肿瘤的诊治水平奠定良好的基础。