论文部分内容阅读
目的：探讨脊髓N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA-R)及代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)参与鞘内吗啡耐受的机制，阐明脊髓蛋白激酶C(C，PKC)和G蛋白亚型(Gp及Gαi/o)表达在这一过程中的作用。
方法：①制作大鼠鞘内置管模型，34只雄性SD大鼠(SD rats)，体重300-350g，随机分入六组，经由Alzet连续输注泵(Model2001)行鞘内连续药物输注：生理盐水对照组，S组，鞘内连续输注生理盐水，1μl/h；吗啡组，M组，鞘内连续输注吗啡，10μg/μl/h；MK-801组，K组，鞘内连续输注MK-801，10μg/μl/h； MPEP组，P组，鞘内连续输注MPEP，10μg/μl/h；吗啡+MK-801组，MK组，鞘内连续输注吗啡(10μg/μl/h)及MK-801(10μg/μl/h)；吗啡+MPEP组，MP组，鞘内连续输注吗啡(10μg/μl/h)及MPEP(10μg/μl/h)。经热板及甩尾实验观察吗啡耐受的发展及干预两类兴奋性氨基酸受体(NMDA-R及mGluR5)后对大鼠行为学反应的影响；②大鼠鞘内经Alzet泵连续输注吗啡五天，吗啡组发生耐受后，经心脏行冰生理盐水灌注，获取腰段脊髓(L3-4)，匀浆处理后，经Real-time PCR检测各组大鼠腰段脊髓mGluR5mRNA的表达；③获得的腰段脊髓组织，经Western Blot定量各组大鼠腰段脊髓PKCα及PKCγ蛋白的表达水平，同时运用Real-time PCR技术测定同段组织中PKCα及PKCγ mRNA的表达；④采用Real-time PCR定量各处理组大鼠腰段脊髓中抑制性Gαi/o蛋白及兴奋性Gβ蛋白的mRNA表达水平。
结果：⑴接入含药物的输注泵后，M组、MK组及MP组大鼠均在第一天展示了良好的机械及热痛的镇痛作用(P<0.01，与S组相比)。甩尾试验中，吗啡组大鼠的镇痛效力随用药天数的增加逐渐减弱，于第五天时镇痛作用丧失，发生吗啡耐受(P>0.05，与S组相比)。MK-801与吗啡合用后可抑制这种抗热痛伤害性作用的降低，于第三天起，与吗啡组相比即有统计学差异(P<0.01)，且在第五天仍有较强的热镇痛效应(P<0.01，与S组相比)。MPEP与吗啡联用后，同样可表达出对吗啡耐受的抑制作用，于第三天起热镇痛效应与吗啡组相比有统计学差异(P<0.05)，而第五天同样保留了较强的镇痛作用(P<0.01，与S组相比)。机械痛实验中得出了相似的结果，吗啡的机械镇痛作用随时间逐渐降低，于第四天时发生镇痛耐受(P>0.05，与S组相比)。MK-801与吗啡合用组在整个用药过程中均显示出良好的机械镇痛作用，于第二天起即表现出与吗啡组的统计学差异(P<0.05，右足)，在第五天未见吗啡耐受发生(P<0.01，与S组相比)。与MK-801类似，MPEP与吗啡合用后，可保持吗啡的镇痛效力，MP组大鼠机械镇痛作用在第三天起与M组相比有明显统计学差异(P<0.05，左足；P<0.01，右足)，并在第五天保持强力的镇痛作用(P<0.01，与S组相比)。单纯的MK-801(10μg/μl/h，i.t.)及MPEP(10μg/μl/h，i.t.)对大鼠的热痛及机械痛无影响(P>0.05，与S组相比)。⑵Real-time PCR结果显示，吗啡可致耐受大鼠腰段脊髓(L3-4)内，mGluR5 mRNA的表达明显增高(P<0.05，与S组相比)，MK-801与吗啡合用可在一定程度上降低大鼠脊髓mGluR5 mRNA的表达(P>0.05，与S组相比)，但未达统计学差异(P>0.05，与M组相比)。而MPEP则可明显降低大鼠腰段脊髓内mGluR5 mRNA的表达(P>0.05，与S组相比)，与吗啡组相比差异明显(P<0.05)。单纯的MK-801(10μg/μl/h，i.t.)及MPEP(10μg/μl/h，i-t.)对大鼠脊髓mGluR5 mRNA的表达无影响(P>0.05，与S组相比)。⑶Western Blot结果显示吗啡耐受大鼠腰段脊髓内PKCα及PKCγ蛋白的表达明显增高(P<0.05，与S组相比)，而Real-time PCR也证实吗啡耐受发生后，大鼠腰段脊髓内PKCα及PKCγ mRNA表达均增高(P<0.05，与S组相比)。MK-801可明显降低吗啡耐受大鼠腰段脊髓内PKCα蛋白表达(P<0.05，与M组相比)，同时，Real-time PCR结果显示，MK组大鼠腰段脊髓内PKCα mRNA的表达未见明显升高，但与吗啡组相比也未显明显差异(P>0.05)。MPEP与吗啡合用后大鼠腰段脊髓内PKCα蛋白表达未见增多(P>0.05，与S组相比)，与M组相比，差异明显(P<0.01)，大鼠脊髓PKCα mRNA的表达增高也被明显抑制(P>0.05，与S组相比；P<0.05，与M组相比)。吗啡耐受后，大鼠脊髓内PKCγ蛋白的表达增高可被MK-801和MPEP抑制(P>0.05，与S组比较；P<0.05，与M组相比)，MK组及MP组大鼠腰段脊髓内PKCγ mRNA的表达未见明显增高(P>0.05，与S组相比)，但与M组相比无统计学差异(P>0.05，与M组相比)。单纯的MK-801(10μg/μl/h，i.t.)及MPEP(10μg/μl/h，i.t.)对大鼠的腰段脊髓PKCα及PKCγ蛋白及mRNA的表达无影响(P>0.05，与S组相比)。⑷吗啡致镇痛耐受后，可同时增加大鼠腰段脊髓内兴奋性Gβ蛋白及抑制性Gαi/o的表达(P<0.01，与S组相比)，而MK-801则能够明显抑制吗啡耐受后所致的这两型G蛋白mRNA的表达增多(P<0.01，与M组相比)，同时，MPEP对吗啡耐受后这两种G蛋白的表达显示出相似的抑制性，MP组大鼠腰段脊髓内Gβ及Gαi/o mRNA的表达未见表达增多(P>0.05，与S组相比；P<0.01，与M组比较)。单纯的MK-801(10μg/μl/h，i.t.)及MPEP(10μg/μl/h，i.t.)对大鼠脊髓Gαi/o和Gβ mRNA的表达无影响(P>0.05，与S组相比)。
结论：①大鼠鞘内吗啡耐受发生后，NMDA受体拮抗剂MK-801可抑制吗啡耐受的发生，同时存在脊髓mGluR5被大量激活。②吗啡耐受可致大鼠脊髓内PKCα及PKCγ的表达增高，继而影响与μ-阿片受体偶联的G蛋白表达，抑制NMDA受体及mGluR5后，可降低这些蛋白的表达增高。③PKC(PKCα及PKCγ)转位激活及与μ-阿片受体偶联的G蛋白信号改变(由抑制性Gαi/o占主导转为兴奋性Gβ为主)可能是脊髓NMDA受体及mGluR5参与鞘内吗啡耐受的重要机制。