一、背景:天然免疫系统是机体抵抗外界病原体入侵的第一道防线,而天然免疫系统对病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）的识别是诱导天然免疫应答,清除入侵病原体的关键步骤。病毒所携带的核酸链就是一类重要的PAMPs,可以被宿主细胞中的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）特异性识别并激活天然免疫通路,进而发挥抗病毒免疫功能。目前已经明确的能够识别病毒自身携带以及复制过程中产生的多种核酸链的PRRs包括:Toll-样受体（Toll-like receptors,TLRs）,视黄酸诱导基因蛋白I（retinoic-acid-inducible gene-I,RIG-I）样受体（RLRs）,以及细胞质中的多个DNA受体。TLRs是一类位于细胞膜结构上的受体,主要表达于免疫细胞,比如树状细胞（Dendritic cells,DCs）、巨噬细胞（Macrophages）,以及B淋巴细胞。位于胞内体（endosomes）膜上的四种TLRs能识别病毒的核酸。其中TLR-3的配体（ligand）是双链RNA（double-strand RNA,dsRNA）,TLR-7和8识别单链RNA（single-strand RNA,ssRNA）,TLR9识别DNA链。与TLR不同,RLRs是存在于细胞质中的RNA链模式识别受体,包括RIG-I,MDA5（Melanoma differentiationassociated gene 5）和LGP2（Laboratory of Genetics and Physiology 2）。其中,RIG-I识别具有5’端三磷酸和二磷酸结构（5’ppp和5’pp）的病毒RNA,MDA5的配体是长链大分子dsRNA,LGP2绑定RNA的活性在三者中最高,但是缺乏下游通路,可能与MDA5协同作用介导病毒RNA的识别和天然免疫的激活。此外,细胞质中还存在大量的DNA受体,比如DAI（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors）,IFI16（Gamma-interferon-inducible protein 16）和cGAS（cyclic GMPAMP synthase）。这些DNA受体以及TLRs和RLRs一旦结合到它们的核酸配体,便招募转接蛋白(adaptors:STING（stimulator of interferon genes）、TRIF、MyD88（Myeloid differentiation primary response gene 88）以及MAVS（Mitochondria antiviral signaling protein）。转接蛋白传递信号给下游的激酶复合体TBK1（TANK-binding kinase）或IKKε（IκB kinase epsilon）,活化转录因子如干扰素调节因子（Interferon regulatory factor）,核因子（Nuclear factorκB,NF-κB）等进入细胞核并调节干扰素以及促炎症因子的转录。一旦天然免疫通路被激活,被感染的细胞生产并分泌出大量的干扰素,这些干扰素作为信号分子能与临近细胞表面的干扰素受体结合,激活JAKSTAT（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription）通路,诱导表达数以千计的干扰素刺激蛋白（IFN stimulate genes,ISGs）。它们功能各异,有些ISGs本身就是信号蛋白,又回到天然免疫通路中去扩大免疫应答反应,当然也有一些能够负调控信号通路以降低免疫应答。除了充当信号分子,有些ISGs直接参与抑制病毒的感染和复制,已知的绝大部分抗病毒蛋白都属于干扰素刺激蛋白。因此,从干扰素刺激基因中筛选机体的抗病毒基因,并开展相关的分子机制研究具有重要的意义。干扰素刺激蛋白20（IFN-stimulated gene 20kDa,ISG20）属于DEDDh外切核酸酶（Exonucelase,Exo）家族。同其他成员一样,ISG20的氨基酸（Amino acids,aa）序列中有一个160aa左右的Exo区域,其中分布着ExoI,ExoII,ExoIII三个基序（motifs）,五个高度保守的氨基酸DEDDh（D11,E13,D94,D154和H149）位列其中。ISG20在体外（in vitro）具有3’端到5’端外切核酸酶活性,能降解RNA和DNA链,对RNA降解能力更强。在细胞内过表达ISG20能抑制多种RNA病毒的复制,包括VSV,HIV-1,EMCV,乙型肝炎病毒（HCV）等等。ISG20的突变体（D94G）丧失了外切核酸酶的活性,并同时失去了抗病毒的能力。鉴于此,多数研究者认为ISG20的抗病毒能力取决于其外切核酸酶活性,但是,关于ISG20是否直接水解病毒的RNA仍有争论。水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）,这一科病毒基因组是单股负链RNA,在细胞中的复制过程不需要进入细胞核,全部发生在细胞质中。VSV作为这类病毒的模式种被广泛应用于实验室研究。VSV的mRNA具有5’端帽子结构,靠帽-依赖的翻译起始机制,但VSV感染细胞后能特异性的翻译自身蛋白而同时抑制细胞蛋白的翻译,说明VSV mRNA的翻译可能不是严格按照标准的帽-依赖的起始方式。人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）的致病因子,属于逆转录病毒科（Retroviridae）。这类病毒的遗传信息存储在RNA基因组中,通过逆转录生成DNA并整合到宿主基因组中。VSV病毒的这些特性给我们对RNA病毒的研究带来了极大的便利,因此,VSV已经成为病毒学和病毒免疫相关研究的重要模式生物。翻译是遗传信息表达的重要一步,可分为起始,延伸和终止三个阶段。很多抗病毒机制是通过调控病毒mRNA的翻译,特别是翻译的起始阶段来实现的。真核细胞中翻译的起始方式主要有两种,即帽-依赖（cap-dependent）和内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）-依赖（IRES-dependent）的翻译起始。细胞的mRNA,以及一些病毒（如VSV）的mRNA具有5’端帽子（cap）结构,一般通过帽-依赖的起始方式进行翻译。而很多病毒的mRNA不具有帽子结构,以及一些细胞mRNA比如cMyc和胰岛素样生长因子1受体（Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor,IGF1R）在特殊条件下（比如压力、癌变）也会通过IRES-依赖的起始方式进行翻译。根据IRES的长度、复杂度、所需转录起始因子以及核糖体在mRNA上的结合位置,IRES-依赖的起始方式又可以细分为四类。很多RNA病毒劫持细胞翻译机器用于自身mRNA的表达,同时又抑制宿主细胞mRNA的翻译。比如脊髓灰质炎病毒（poliovirus）和柯萨奇病毒（Coxsackievirus）通过IRES-依赖的起始方式进行翻译,且不需要真核起始因子eIF4E的参与。他们的蛋白酶可以剪切掉真核起始因子eIF4G中与eIF4E结合的部分,使它们无法结合,从而抑制帽-依赖起始的细胞mRNA的翻译。脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）和VSV的翻译也不需要eIF4E的参与,他们通过活化eIF4E绑定蛋白（eIF4E binding protein 1,4EBP1）,使eIF4E磷酸化并失活。细胞中也存在许多干扰素刺激蛋白可以调控病毒蛋白的翻译,比如蛋白激酶R（Protein kinase R,PKR）和抗病毒锌指蛋白（zinc finger antiviral protein,ZAP）,病毒在宿主细胞中特殊的翻译机制给抗病毒研究带来了巨大的便利,靶向特定病毒翻译机制的抗病毒机理研究为后期的抗病毒药物研发提供了重要的理论基础。二、结果:已有的研究仅仅关注了D94G这一种突变体,难以总结ISG20核酸酶活性与抗病毒能力的相关性。为了解决这一问题,更好地了解ISG20的抗病毒机制,我们比对了ISG20在12个物种中的氨基酸序列,根据序列信息构建了多个ISG20的突变体。除了经典的D94突变体（M1）,其他突变体我们都选择了Exo基序区域外的位点。最终,转染细胞后表达良好的M1（D94/A）,M2（S129/A）,M21（S129/A+Q143/R）,M3（L137L138/AA）,M4（R114L115L116/AAA）,和M5（R169A170R171R172/AAAA）被选为突变体的最终名单进行后续实验。除了突变体,在本研究的初始阶段,我还构建了一系列ISG20的稳转细胞系。这些稳转细胞系的构建基于pRetroXTetON系统,这一系统的质粒骨架是逆转录病毒（小鼠白血病病毒,Murine leukemia virus,MLV）,并且有TetON诱导性表达调控元件.可以将携带的ISG20基因整合到细胞基因组中,并通过添加多西环素（Doxycycline）诱导ISG20的表达。ISG20的核酸酶活性不足以决定其抗病毒能力。前人的研究曾经在体外证实在细菌中表达纯化的ISG20同时具有DNA和RNA酶活性。我们采用免疫沉淀的方法直接纯化在人HEK293T细胞中表达的ISG20,这种方法得到的ISG20蛋白仍具活性,并且其潜在的辅助因子（co-factor）也可能与ISG20一起沉降出来,更好地模拟了ISG20在真核细胞中的作用情景。我们得到的结果表明ISG20能特异的剪切各种RNA链,但对DNA底物却作用甚微或者说没有作用。人工合成的双链RNA,无论是平末端还是粘性末端,都能被ISG20有效水解,ISG20也能水解杂合的DNA:RNA双链,但效率远低于前者。在ISG20的突变体中,除了M1失去RNA酶活性外,其他所有的突变体仍具有体外酶切RNA的能力。接下来,利用ISG20及突变体的稳转细胞系,我们证明,在多种细胞系中,过表达ISG20可以显著抑制VSV复制全能株（VSV Indiana）的复制。然而,在突变体中,M21,M3和M4虽然仍具有外切核酸酶的活性,却像M1一样丧失了抑制VSV复制的能力。考虑到突变可能导致ISG20在细胞中位置的改变,我们进行了免疫荧光实验,结果表明虽然ISG20突变体的细胞定位不尽相同,但与它们抗病毒的能力并无直接的相关性。由此看来,ISG20突变体的核酸外切酶活性与他们的抗病毒活性并不完全吻合,也就是说ISG20的内切核酸酶活性并不足以支撑其抗病毒的能力。ISG20还可能存在其他的,不依赖核酸外切酶活性的抗病毒机制。ISG20通过抑制翻译过程影响病毒复制。在上述实验的同时,我们还发现ISG20能强烈影响转染进细胞中的外源基因的表达。所有与ISG20共转染的质粒,其编码蛋白的产量都受到了显著的抑制。遗传信息从DNA流向RNA,然后流向蛋白质。为了研究ISG20的抑制作用发生在哪一阶段,我使用了多种DNA作为报告基因进行与ISG20的共转染实验。结果表明,ISG20不影响共转染报告基因的DNA和mRNA表达水平,也不影响mRNA从细胞核到细胞质的运输。无论有无内含子,报告基因的表达同样受到ISG20的抑制,说明抑制作用也不在于mRNA的剪接。最后,可能性落自然而然的落在mRNA的翻译上面。事实如此,利用放射性硫标记的方法,我们发现ISG20显著抑制共转染TREX1的翻译过程。以上结果表明ISG20通过对翻译的抑制作用阻止外源基因的表达。将这一实验应用到所有突变体,我发现ISG20突变体们抑制外源报告基因表达的活性与他们的抗病毒活性完全一致,而且,这一活性决定于ISG20突变体对翻译的抑制能力。也就是说,ISG20突变体的翻译抑制能力和它们对VSV抑制能力完美吻合。这使我们怀疑,ISG20是否通过同样的机制抑制病毒蛋白的翻译以达到抗病毒效果。为了检验这一假设,ISG20和突变体M1被选为代表用以研究在他们的存在下,VSV病毒的mRNA水平以及翻译水平的变化。结果表明,虽然在表达ISG20的细胞中VSV的mRNA水平降低了2倍左右,但高达10倍左右的对翻译的抑制作用是其抗病毒活性的主要贡献力量。在M1表达的细胞中,无论mRNA还是翻译水平都无变化。ISG20对翻译的抑制作用不在翻译的起始阶段。mRNA的翻译是一个高度复杂的过程,已发现的影响mRNA翻译的蛋白绝大多数作用于翻译的起始阶段。我们集中了大量的荧光素酶报告质粒,在这些报告质粒中荧光素梅的翻译方式代表了帽-依赖以及IRES-依赖的翻译起始的各个类别。结果发现ISG20能非特异性的抑制所有报告质粒中荧光素酶的表达,说明ISG20对翻译过程具有普遍的抑制作用,且这一抑制并不发生在翻译的起始阶段。此外,我们还发现,ISG20还能在多种细胞系中抑制HIV-1复制全能株（HIV-1 NL4-3）的复制,说明ISG20有作用于不同科的病毒的潜力。进一步探明ISG20对其他病毒的抑制能力,以及这些抑制作用是否依赖于阻止病毒mRNA的翻译,是接下来的工作重点。我们利用CRISPR-Cas9技术构建了敲除isg20基因的小鼠,初步的实验结果表明敲除isg20能显著增强VSV在小鼠体内的复制,验证了内源表达的ISG20在抑制病毒扩增中的重要作用。综上,我们证明ISG20在体外具有强大的核糖核酸酶活性,这一活性十分保守,突变体中除了M1其他的都仍具有核酸酶活性。ISG20能抑制VSV和HIV-1在多种细胞内的复制,但是,突变体中M21,M3和M4丧失了抗病毒能力,说明ISG20的核酸酶活性并非其抗病毒能力的唯一决定因素。而另一方面,ISG20能显著抑制外源mRNA的翻译,并且ISG20突变体的翻译抑制能力与它们的抗病毒能力完全吻合。VSV复制过程中虽然其mRNA水平检测到降低2倍左右,但其翻译过程受到的抑制（大约十倍）却远远超过前者,是ISG20抗病毒能力的主要决定力量。这一结果揭示了一个新的抗病毒机理,虽然这一机理还需要更进一步的检验。目前,对翻译抑制的机理研究还在继续,初步的实验结果显示ISG20并不特异性抑制翻译的起始阶段。与此同时,活体实验的结果表明在小鼠体内敲除ISG20基因会导致小鼠更易受VSV的感染,与过表达实验结果相吻合,说明ISG20在宿主细胞抗病毒应答中起到重要作用。三、讨论和展望:在本研究之前,所有关于ISG20抗病毒的研究中都只用了D94G这一个突变体,它失去了核酸酶活性,也不再具备抗病毒能力,因此这些结果常被用来阐释ISG20的抗病毒能力取决与它的酶活性。其他突变体的加入使我们确认,ISG20的酶活性固然重要,但并不是其抗病毒能力的唯一决定因素。M21,M3和M4三个突变体虽然仍有很高的外切核酸酶活性,但却不再具备抑制VSV复制的能力。虽然与ISG20WT相比,这些突变体在细胞内的分布有所改变,但是与它们的抗病毒活性并无直接关联。例如M4和M5在细胞中的分布模式完全相同,但是抗病毒能力却大相径庭。从我们得到的多条结果看来,ISG20并不剪切外源表达的mRNA。因为在ISG20的存在下,DNA转染进细胞后其mRNA水平没有改变,直接转染进细胞的mRNA也没有被降解,VSV病毒蛋白的翻译受到严重的抑制,但在mRNA水平上只检测到中等的抑制作用。而且病毒mRNA的减少很有可能不是由于被直接水解掉,而是由于ISG20的存在下感染VSV的细胞数量少。在转染DNA/RNA或者病毒感染条件下,这些外源的DNA/RNA大量表达,而过表达ISG20能抑制这些外源mRNA的翻译过程从而控制它们的表达。接下来我们还将检验在敲除isg20的小鼠细胞内,病毒蛋白的翻译水平是不是也得到了提高。ISG20的抑制作用主要发生在翻译阶段。而荧光素酶报告质粒的共转染实验表明无论是cap依赖的还是IRES-依赖的翻译模式都受到了ISG20的抑制,说明ISG20的抑制作用并非发生在翻译的起始阶段。现阶段我们在进行核糖体核糖体分析（ribosome profiling）实验,以期检测ISG20是否与特定的核糖体组份关联,以及ISG20是否影响报告基因的mRNA在核糖体各组份间的分布。VSV的mRNA具有与真核生物mRNA类似的帽子结构,也被认为按照标准的cap依赖的方式进行翻译,但这样很难解释为什么VSV能够单一的翻译自身的mRNA而抑制宿主细胞mRNA的翻译。最近的一项研究筛选出了一个核糖体蛋白rpL40,对于VSV的翻译不可或缺。ISG20可能通过干扰rpL40来影响VSV的翻译,探索ISG20与rpL40的潜在关联也是我们近期的任务。