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目的：本课题目的是寻找阿片受体在长期激动后，特异性介导阿片受体磷酸化脱敏的胞内信号分子，以期进一步探讨阿片受体耐受和依赖的分子生物学机制，为阿片类物质成瘾机制的研究开辟一个新方向。研究内容和方法：本研究采用细菌双杂交系统这一新发展起来的发现蛋白与蛋白之间相互作用的技术，首先以mRNA为模板经过逆转录、LD-PCR构建了吗啡依赖大鼠的脑cDNA文库，用μ阿片受体C—末端(MOR-C)59aa为诱饵，以HIS3报告基因的转录激活为初步筛选指标筛查了约3×10~6个共转化子，以aadA基因转录激活进一步验证初步筛选所得到的阳性克隆。提取HIS3和aadA双重筛选验证有相互作用的阳性克隆，排除其自身激活活性后，对最后筛选得到的阳性克隆测序并BLASTnr比对，选择其中可能有意义的蛋白进行了体外pull-down实验验证其与MOR-C的相互作用，并进一步在HA-μ-CHO细胞内通过共定位和免疫共沉淀验证了靶蛋白与μ阿片受体的相互作用。主要结果：1构建了吗啡依赖及正常大鼠的脑cDNA文库，库容量达10~6，插入片段在1kb左右，重组率＞90％，可以满足文库筛选要求。2以μ阿片受体C—末端为诱饵，用细菌双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库，经三轮60块15cm平板筛选共转化子约1.2×10~6，初步筛选得到154个阳性克隆，双重筛选验证为124个克隆。分离pTRG-cDNA单克隆，进一步与诱饵质粒pBT-C共转化，筛除具有自激活活性的克隆后，得到19个阳性克隆。3 19个阳性克隆测序并BLASTp比对，筛选的已知蛋白有：神经营养因子受体p75NTR相关的细胞凋亡因子(NADE)、A20结合蛋白ABIN1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、胰岛素样生长因子2、热休克蛋白、锌指蛋白216以及线粒体、染色体基因组等，未知蛋白有5个。4体外实验将MOR-C与GST融合，靶蛋白NADE、ABIN1与His融合，通过正反向pull-down实验证明：NADE与MOR-C有相互作用；ABIN1与MOR-C也有相互作用。但体外蛋白与蛋白相互作用还需要进行细胞内相互作用的进一步验证。5细胞内共定位研究表明，靶蛋白NADE主要分布于胞浆，与MOR在CHO细胞有共定位，即NADE与MOR-C存在相互作用的可能；ABIN1在细胞内弥散分布，与MOR在细胞内存在共定位。免疫共沉淀进一步证明了靶蛋白NADE、ABIN1与MOR的相互作用，为下一步研究蛋白对MOR功能的影响提供了依据。结论本研究首次构建了吗啡依赖大鼠的脑cDNA文库，利用细菌双杂交技术以μ阿片受体C—末端为诱饵筛选cDNA文库，筛选出与MOR-C相互作用的靶蛋白NADE和ABIN1。体外和细胞内实验进一步验证了靶蛋白与MOR的相互作用，NADE和ABIN1是细胞生理活动中非常重要的蛋白，国内外尚无该蛋白与MOR相互作用的报导。其与MOR的相互作用及对MOR信号转导的影响有待于进一步研究。