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目的:通过体内和体外实验证实骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)可发生恶性转化而成为肿瘤的起源细胞,并阐述BMSCs恶性转化的相关机制。
方法:1、全骨髓贴壁法提取、扩增健康SD大鼠胫骨、股骨内的BMSCs,联合形态学,细胞表面标志及多向分化潜能对BMSCs进行鉴定;2、体外进行BMSCs长期培养以研究BMSCs自发性转化;3、通过细胞毒性实验确定化学致癌物4-硝基喹啉1-氧化物(4-Nitroquinoline l-Oxide,4-NQO)用药浓度,从BMSCs群体倍增水平(population doublings level,PDL)3开始每次传代后给予含4-NQO的培养液培养1小时,如此间断地给药直至细胞衰老停止药物作用,以此方法进行BMSCs恶性转化诱导实验;4、通过细胞增殖实验、软琼脂克隆凝集实验、细胞周期流式检测等方法确定BMSCs及BMSCs转化细胞的生长特性;5、制备BMSCs及BMSCs转化细胞的染色体标本,进行G显带核型分析;6、将BMSCs细胞及BMSCs转化细胞以PKH26标记后,通过尾静脉输入免疫缺陷小鼠体内进行体内成瘤实验。细胞回输后2~8w,动物处死,取小鼠各部分组织制备石蜡及冰冻切片。石蜡切片进行HE及免疫组织化学染色,确定有无肿瘤的形成及肿瘤的性质。荧光显微镜下观察冰冻切片,确定肿瘤细胞是否起源于回输细胞;7、提取不同PDL BMSCs及BMSCs转化细胞总蛋白及DNA,Western Bolt方法检测p53及p21表达水平,PCR-Elisa法检测端粒酶活性,Southern Blot方法检测端粒长度,以探讨BMSCs恶性转化的相关机制。
结果:1、原代取材后的BMSCs,形态呈梭形或多角形,多为平行排列生长或旋涡状;细胞CD34、CD45、CD86、MHC-II的表达均为阴性,而CD90为强阳性表达,CD106为弱阳性表达;细胞可分化为软骨细胞,心肌细胞及神经细胞;2、BMSCs在体外长期培养扩增至PDL25~PDL30,细胞进入衰老期。继续培养2~4w,3个细胞克隆度过衰老期,发生自发性转化,成为自发性转化BMSCs细胞(spontaneous transformed BMSCs,sTMCs);3、4-NQO对BMSCs的半数致死浓度为3×10-6M;BMSCs接受44-NQO作用3次,BMSCs即呈现出衰老样细胞表现,继续培养30%的细胞可度过衰老期,呈克隆样生长。发生转化的细胞呈小多角形;细胞表面标志物CD90及CD106表达水平下降;细胞多向分化潜能降低。该转化细胞为诱导转化BMSCs细胞(inducedtransformed BMSCs,iTMCs):4、sTMCs和iTMCs具有无限增殖能力,失去接触抑制性及生长锚着依赖性;5、BMSCs具有正常细胞核型,sTMCs和iTMCs细胞核型即有染色体数目异常又有染色体形态异常改变;6、sTMCs及iTMCs均可致免疫缺陷小鼠成瘤,iTMCs同sTMCs的致瘤动物数分别为12/12和6/12,iTMCs具有更强的致瘤能力,恶性程度更高;7、BMSCs无端粒酶活性,sTMCs及iTMCs均具有高端粒酶活性;p53及p21在sTMCs及iTMCs表达缺失。
结论:1、BMSCs在体外长期培养时发生自发性恶性转化;2、BMSCs在化学药物4-NQO作用下发生恶性转化,是化学致癌物作用的靶细胞;3、BMSCs自发性及诱导性恶性转化是肿瘤发生的起源细胞之一;4、端粒酶活性增加,p53表达缺失、染色体突变累积是BMSCs发生恶性转化的主要机制。