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实验室前期研究发现,OsCCX2在水稻茎节中,调控重金属Cd从根到地上部分的转移,以及地上组织包括籽粒中的分配。OsCCX2/Os NCX8是一个假定的钠-钙交换体蛋白,属于CaCA蛋白家族中NCX亚家族成员,到目前为止,有关植物钠-钙交换体蛋白功能的研究还很少。开展OsCCX2互作蛋白的研究,对于进一步了解OsCCX2的生物学功能、阐明水稻通过钙信号调控耐逆和生长有重要的意义。本研究通过酵母双杂交技术筛选和鉴定了与OsCCX2发生相互作用的蛋白,并进一步进行了信息学分析和功能的初步鉴定。获得的主要结果如下:1.利用酵母双杂交技术筛选到77个可能与OsCCX2具有相互作用的蛋白,标为OsCIP1-OsCIP77,其中,有参与糖类合成与代谢的蛋白;参与细胞内运输和分泌的蛋白;参与植物中某些信号转导途径来应对非生物胁迫的蛋白;参与离子运输的蛋白;对蛋白磷酸化或去磷酸化等修饰作用的蛋白激酶与蛋白磷酸酶;对靶蛋白泛素化降解起重要作用的泛素蛋白酶;还有一些与核糖体结构相关的蛋白。2.从77个候选互作蛋白中,选择了感兴趣的7个蛋白(OsCIP1、OsCIP2、OsCIP3、OsCIP4、OsCIP5、OsCIP6、OsCIP7)进行酵母互作一对一验证。OsCIP1是一种类DNA损伤结合蛋白DDB1,对基因的稳定发挥重要作用。OsCIP2是一种类PIP1-1的水通道蛋白,在水稻叶片和根部最丰富,且对环境胁迫高度响应,适度表达OsPIP1;1基因可增加水稻籽粒产量、耐盐性、根部渗透系数及种子萌发率。OsCIP3是一个类似MYBS2的转录因子,MYB类转录因子在调控逆境应答基因的表达中起着重要的作用。Os CIP4是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,OsCIP5是一种Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶,这两种蛋白激酶可能特异地催化底物蛋白OsCCX2上的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,从而调控OsCCX2的转运活性。OsCIP6是一种海藻糖-6-磷酸合酶,海藻糖-6-磷酸合酶与海藻糖的形成有关,而海藻糖的累积会导致非生物性胁迫耐性的改善。OsCIP7是E3泛素蛋白连接酶RFI2,泛素连接酶E3主要通过调控蛋白质的泛素化,来介导蛋白酶体依赖性的蛋白降解。结果显示选择进行验证的这七个蛋白并没有自激活现象,其中Os CIP1、OsCIP2、Os CIP3、OsCIP4、OsCIP5这5个蛋白可以在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基上长出白色酵母菌落,在SD/-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal培养基上长出蓝色酵母菌落,推测OsCCX2与这5个候选蛋白之间存在互作关系。3.将OsCCX2互作蛋白基因在osccx2突变体与野生型幼苗地上部分进行表达量分析,结果发现这5个互作蛋白基因在osccx2突变体中的表达量均高于野生型,其中Os CIP1在osccx2突变体中的表达量是野生型的近5倍,OsCIP2在osccx2突变体中的表达量比在野生型中高约7倍,OsCIP3与OsCIP5在osccx2突变体中的表达量是野生型的近3倍。4.将日本晴野生型水稻幼苗分别用20%PEG与100 mM NaCl处理,发现这5个与Os CCX2互作蛋白的基因的表达量随处理时间的不同发生了不同程度的改变,表明这5个基因同OsCCX2一样会受到NaCl及PEG的诱导。在100 mM NaCl诱导下,OsCIP2与OsCIP3在4 h时表达量达到最高值。在20%PEG诱导下,OsCIP1与OsCIP2在4 h时表达量达到最高值,与Os CCX2表达量峰值达到时间一致。5.利用5个互作蛋白基因组序列设计基因编辑靶位点,构建敲除载体,以水稻日本晴为背景,通过遗传转化获得Os CIP2、OsCIP3、OsCIP4、OsCIP5这四个基因的敲除阳性水稻植株,选取纯合突变体进行接下来的实验。6.对oscip2、oscip3、oscip4、oscip5这4个基因的突变体和WT的农艺学性状进行了初步观察,发现突变体的花粉育性与野生型相比没有受到太大影响,均表现为可育。oscip4突变体幼苗的株高显著低于野生型。将oscip4突变体与野生型同时萌发的幼苗在100 mM NaCl的1/2MS培养基处理,经统计,野生型与突变体幼苗经盐处理后地上部分的生长抑制率分别为19.6%与37.5%。未经盐处理的野生型与突变体地上地下部分的比率为2.5与1.91,经盐处理后野生型与突变体地上地下的比率为1.8与0.9。说明oscip4突变体与野生型相比,突变体幼苗生长被抑制程度更高,对盐胁迫更敏感。综上所述,OsCCX2作为一个假定的钠-钙交换体蛋白,在维持细胞内钙离子的稳态平衡中起重要的作用。通过对OsCCX2互作蛋白的筛选,发现OsCCX2可能与OsCIP1、OsCIP2、OsCIP3、Os CIP4、OsCIP5这五个蛋白相互作用,且这五个互作蛋白基因同Os CCX2相似,受NaCl与PEG诱导。对oscip4突变体幼苗分析发现,它会受到NaCl的抑制,对盐胁迫敏感。