背景：空化效应是指液体中微泡在超声波作用下发生振荡、膨胀、收缩、内爆等变化,产生瞬态高温、高压、冲击波及喷射流等多种能量释放行为。有研究表明,超声击破微泡产生的物理流能使离体肿瘤细胞膜表面产生孔隙,增大细胞膜通透性,从而提高细胞药物摄取量,增强药物的细胞毒性作用,促使细胞死亡。该发现引起超声界普遍关注,并尝试将其用于治疗恶性肿瘤。恶性肿瘤的治疗一直是临床工作的重点和难点,化疗是其主要治疗手段之一,但多药耐药(Muti-drug resistance,MDR)的情况频繁发生,使得化疗的总体成功率不高,成为治疗肿瘤的最大障碍。多药耐药是指肿瘤细胞接触了某种抗癌药物后产生了对其他多种未接触过的、结构和作用机理完全不同的抗癌药物的耐药性。有研究表明,多因素致肿瘤细胞对抗癌药物摄取减少是MDR主要的生物化学机制之一。国内外学者尝试通过超声增强离体肿瘤细胞化疗效果并取得初步成果,展示出诱人前景。但在体肿瘤细胞不同于离体肿瘤细胞,前者与微泡之间有微血管及组织间隙隔离；而后者微泡可紧贴离体细胞,微泡被超声击破产生的物理流与离体细胞距离近,作用力大。虽有研究报导,单纯超声也可使离体肿瘤细胞膜表面产生裂隙,增加化疗药的细胞毒性,但单纯超声作用于活体时由于生物体内缺乏自身空化核,通常需要较高声压激励才能产生杀伤作用,可出现损伤周围正常组织等副作用,可控性差。载药微泡是将治疗性药物粘附、结合或镶嵌在微泡被膜层甚至整合在微泡内部,在血液中可减少与其他药物作用或体内酶反应,联合超声辐照可实现靶向药物释放,增加靶区药物浓度,达到治疗病灶的目的。但由于微泡壳上载药的“空穴”受限,载药量少。若增加微泡壁的厚度可提高载药量,又会加大微泡制作工艺的难度。有学者在小鼠后肢皮下建立肝癌模型,观察到靶向超声微泡爆破组的肿瘤伊文思蓝渗出量明显高于单纯超声辐照组,证实靶向超声微泡爆破能增加肝癌毛细血管的瞬间通透性,加大化疗药物在组织间隙的弥散,达到治疗肿瘤的目的。但微泡能否穿越血管壁上的孔隙进入组织间隙并产生二次甚至多次空化还是个未知的问题,并且超声声孔效应能否在活体肿瘤细胞膜上“打孔”,增加细胞膜甚至核膜通透性,增强肿瘤化疗效果的研究也未见报道。目的：本研究利用硝酸镧示踪电镜观察活体VX2肿瘤细胞膜通透性改变,了解超声治疗仪不同声强、脉冲宽度、辐照时间和不同微泡剂量下声孔效应致肿瘤细胞膜及核膜等超微结构改变,能否在细胞膜甚至核膜上产生孔隙,并摸索出增大肿瘤细胞膜通透性的适宜声学参数；在此基础上,进一步探讨超声联合微泡致声孔效应对VX2肿瘤化疗效果的影响。材料和方法：1.主要实验材料实验仪器：CZ-906A型超声治疗仪,探头直径2.5cm,面积4.9cm2,声强在0.21W/cm2～1.09W/cm2可调,脉冲宽度在1.21ms-6.05ms可调。Philips IU22彩色多普勒超声仪,L9-3高频线阵探头,配有超声造影模式。Hitachi H-600型透射电了显微镜。超声微泡：南方医院药学基地研制的“全氟显”,为冻干人血白蛋白包裹全氟丙烷气体,每支用前加入3ml生理盐水,然后缓慢摇匀制成混悬液备用。所产生的微泡平均直径2.9μm,其中98%<7gm,微泡浓度1-2×109个/ml。其他试剂：速眠新Ⅱ注射液,阿托品,3%戊巴比妥钠,阿霉素,生理盐水。实验动物：健康新西兰白兔73只,雌雄不限,体质量2.0-2.5kg,由南方医院实验动物研究中心提供。VX2肿瘤组织匀浆由广州中山大学实验动物中心提供。2.动物模型制备2.1超声致微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤细胞通透性的适宜声学参数的研究：以0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液及0.25ml/kg阿托品注射液将后肢外侧肌层内荷VX2肿瘤的新西兰白兔肌肉注射麻醉,并建立耳缘静脉通道以注射适量3%戊巴比妥钠,侧卧位固定于实验台上,荷瘤部位及其周围1.5cm处脱毛,充分暴露,碘伏及酒精先后分别消毒两次,无菌条件下取出肿瘤,并迅速剔除周边结缔组织及中央坏死区,将保留的新鲜鱼肉样组织置于无菌生理盐水中,眼科剪将其剪成1mm3的小块,分别接种于45只健康新西兰白兔双侧后肢外侧肌层内,约14天后用于实验。2.2超声微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤化疗效果的实验研究：前与(1)相同,用眼科剪剪成1mm3的小块后分别接种28只健康新西兰白兔右后肢外侧肌层内,约11d后用于实验。3.实验流程3.1超声致微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤细胞通透性的适宜声学参数的研究：以声强、脉冲宽度、辐照时间、微泡剂量为处理因素将符合实验条件的38只肌层内荷VX2肿瘤新西兰白兔分成四组,依次考察各处理因素。考察某一因素各水平间差别时其他因素的水平固定不变。每一水平重复实验5次。严格设置各处理因素不同水平的条件,辐照时超声探头置于肿瘤体表处,同时经静脉通道连续、缓慢注入微泡。治疗结束后立即用锋利刀片切开肿瘤最突出体表处并切取肿瘤边缘鱼肉样组织,制作组织切片,利用硝酸铡示踪透射电镜观察肿瘤细胞通透性的变化,并对各处理因素的每个水平随机选取3个肿瘤组织用以HE染色病理检查。前一处理因素的最佳参数水平确定后即可考察后一处理因素,依次得出四个因素的适宜声学参数。3.2超声微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤化疗效果的实验研究：将符合实验条件的24只右后肢肌层内荷VX2肿瘤新西兰白兔随机分为阿霉素组、阿霉素+微泡组、阿霉素+超声组、阿霉素+微泡+超声组。阿霉素+微泡+超声组经静脉注射化疗药,2min后运用脉冲式超声治疗仪在肿瘤部位辐照,同时经静脉连续、缓慢注入微泡。阿霉素+超声组用3ml生理盐水代替微泡缓慢推注；阿霉素+微泡组超声治疗仪不发射超声能量；阿霉素组仅用3ml生理盐水代替微泡缓慢推注,亦不发射超声能量。每次作用10min,隔天治疗一次。治疗前采集各时间点二维超声图像和超声造影图像,测量肿瘤切面最大长径、厚度及宽度,观察肿瘤体积变化。4.数据分析肿瘤细胞膜通透性改变以细胞内镧颗粒数目为观察指标,按镧颗粒数目多少分为0-5级,采用SPSS13.0统计分析软件包对数据进行处理,同一处理因素水平间镧颗粒数目评分比较采用Kruskal-Wallis H检验,若同一处理因素总体差异有统计学意义,则采用Mann-Whitney U检验对任意两水平间进行比较。肿瘤化疗效果以肿瘤体积为观察指标,肿瘤体积大小用x±s表示,治疗前、后各时间点、各组肿瘤体积大小比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.超声致微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤细胞通透性的适宜声学参数的研究：声强为0即超声不发射能量时肿瘤细胞浆内未见镧颗粒。声强为0.21W/cm2、0.43W/cm2、0.65W/cm2时均观察到肿瘤细胞浆内镧颗粒存在。声强是0.43W/cm2时细胞浆内镧颗粒数目评分较其他水平高(P<0.01)。脉冲宽度为2.42ms时肿瘤细胞浆内镧颗粒数目评分较其他水平高(2级,P<0.05)。辐照时间为10min时肿瘤细胞浆内镧颗粒数目评分与其他水平比较差异有显著统计学意义(P<0.05)。肿瘤细胞浆内镧颗粒沉积随微泡剂量增加而有上升趋势,剂量在0.50ml/kg时评分最高(2-3级,P<0.05)。各处理水平下细胞核内均未见镧颗粒存在。2.超声微泡声孔效应增强兔VX2肿瘤化疗效果的实验研究：兔VX2肿瘤在13天的实验周期内,阿霉素+微泡+超声组、阿霉素+微泡组、阿霉素+超声组、阿霉素组的肿瘤平均体积,从0.42±0.36cm3、0.70±0.62cm3、0.55±0.30cm3、0.53±0.42cm3生长至0.48±0.44cm3、1.61±1.06cm3、1.89±0.81cm3、1.62±0.69cm3,阿霉素+微泡+超声组肿瘤体积明显小于其它三组(P<0.05)。阿霉素+微泡组、阿霉素+超声组、阿霉素组肿瘤体积大小差异无显著统计学意义(P>0.05)。阿霉素+微泡+超声组的肿瘤生长率最小,明显低于其他三组。阿霉素+微泡+超声组、阿霉素+微泡组、阿霉素+超声组的肿瘤生长抑制率相对于阿霉素组依次为70.4%、0.6%、-16.7%。结论：1.超声致微泡声孔效应不仅能在微血管内膜上产生孔隙,微泡还能穿过增大的孔隙到达肿瘤细胞周围的组织间隙发生空化效应；或者微血管内的微泡首次被超声波击碎后可能变成更小的微气泡,这些更小的微气泡受超声辐射力的驱动穿越增大的微血管内皮孔隙进入肿瘤组织间隙,并产生二次甚至多次声孔效应。2.超声致微泡声孔效应引起在体肿瘤细胞膜通透性改变呈现一定规律性。3.适宜声学参数下,超声辐照联合微泡致声孔效应能明显增加在体肿瘤细胞膜通透性,增强肿瘤化疗效果,有望成为一种新型、无创、可重复的在体肿瘤化疗方法。