背景与目的在神经系统中,神经胶质瘤是常见的一种原发性恶性脑肿瘤,其中82%以上为神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)。神经胶质母细胞瘤是一种恶性程度非常高的胶质瘤,积极治疗下神经胶质母细胞瘤中位生存期仅为15个月。以神经胶质母细胞瘤为代表的中枢神经系统恶性肿瘤给患者及家庭带来沉重的精神压力及巨大的经济负担。深入研究神经胶质母细胞瘤的发病机制、探索药物作用靶点,寻找有效的治疗药物和治疗方法仍是临床神经胶质瘤研究的热点。信号转导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)是一个转录因子大家族,其信号通路与肿瘤的发生密切相关,存在于各种各样的细胞生理过程中,包括细胞分化、存活或者生长。其中,近年来STAT5是在哺乳动物7个STAT家族成员中研究比较活跃的转录因于。STAT5在包括宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达,已被确认为是癌基因,STAT5能够调节一些肿瘤细胞的增殖和凋亡。它的激活作用已经在血液系统恶性肿瘤上得到证实。阻断胰腺癌细胞中STAT5信号传导通路可抑制其增殖功能。STAT5a和STAT5b是STAT5的两个亚型,其同源性达到了96%。虽然STAT5a和STAT5b只有羧基端不同,但两者存在不一样的功能。异常的情况下过度表达的STAT5对神经胶质母细胞瘤的发生、发展过程有着重要的促进作用。STAT5a和STAT5b在肿瘤中承担的角色以前的研究尚未阐明清楚及加以区分。Liang等研究了STAT5a及STAT5b两亚型在人类神经胶质母细胞瘤中的具体作用,研究的结果显示,STAT5b通过调节基因的表达,例如Bcl-2、p21(waf1/cip1)、p27(kipl)、FAK和VEGF,与神经胶质母细胞瘤细胞形成、细胞周期、转移有着密切的关系。免疫组织化学染色法显示,STAT5b在神经胶质母细胞瘤细胞质的染色阳性率(57.1%)与正常大脑皮质(22.2%)及弥漫性星形细胞瘤(27.3%)相比有显著统计学意义。说明在人类的神经胶质母细胞瘤形成进展中STAT5b可能有着重要的生物学意义。目前对神经胶质母细胞瘤细胞系中STAT5b的表达及下调STAT5b的机制研究相对较少。故本研究以神经胶质瘤临床样本及神经胶质瘤细胞系为研究对象,检测JAK1和STAT5b在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,探索神经胶质瘤组织中是否存在STAT5b的过度激活及异常表达,探讨JAK1/STAT5b信号通路在神经胶质瘤发生发展中的作用,并探讨沉默STAT5b的表达对人神经胶质母细胞瘤U251细胞增殖能力及凋亡的影响及其机制,为神经胶质瘤的基因治疗提供一定的理论参考。方法收集神经胶质瘤组织样本和不同神经胶质瘤细胞系(人脑胶质瘤细胞系U-373MG、U251、TJ905、TJ899和A172,小鼠胶质瘤细胞系G422),采用RT-PCR方法检测神经胶质瘤组织、正常脑组织以及不同胶质瘤细胞系中JAK1和STAT5b的mRNA表达水平,采用蛋白印迹杂交技术检测神经胶质瘤组织、正常脑组织以及和不同胶质瘤细胞系中JAK1和STAT5b的蛋白表达水平；检测STATSb上下游基因VEGF、bcl-2、survivin、bax等的蛋白表达水平变化,确认STAT5b在胶质瘤信号通路中的节点地位；进一步,我们采用RNA干扰技术沉默STAT5b的表达,检测STAT5b沉默后神经胶质瘤细胞增殖能力的变化及凋亡相关基因的变化,以确定STAT5b在神经胶质瘤发生发展中的作用。结果STAT5b在神经胶质母细胞瘤中呈活化状态,同时发现JAK1在胶质母细胞瘤组织中同样呈现活化状态,JAK1与STAT5b在胶质母细胞瘤中的表达呈正相关。人脑胶质瘤细胞系U-373MG、U251、A172、小鼠胶质瘤细胞系G422四种细胞株中磷酸化JAK1和磷酸化STAT5b均呈高水平表达,提示JAK1/STAT5b信号转导通路是神经胶质瘤信号转导通路的一条重要通路。四种神经胶质瘤细胞中凋亡抑制基因bcl-2与survivin表达水平显著增加, 凋亡基因bax表达较低,说明神经胶质瘤细胞中JAK1/STAT5b可能与VEGF、survivin、bcl-2及bax等调控肿瘤细胞凋亡和增殖的基因密切相关,JAK1/STAT5b在胶质瘤信号通路中处于节点地位,调控JAK1/STAT5b将影响胶质瘤的凋亡及／或增殖,从而实现调控胶质瘤细胞生长。STAT5b干扰质粒的构建,以GENE BANK提供已知序列STAT5作为靶点,体外合成siRNA单链结构,退火后形成双链结构。测序结果与靶向STAT5b序列完全相同,证明以Pgenesil-1为载体构建STAT5b干扰质粒成功(Pgenesil-1-ShSTAT5b)。同时将siRNA序列无规则打乱,以连有EGFP标签的Pgenesil-1为载体构建质粒作为阴性对照(Pegenesil-1-HK)。激光共聚焦显微镜检测人神经胶质瘤细胞U251转染效果,可见未转染U251细胞无绿色荧光表达,转染Pegenesil-1-HK和Pgenesil-1-ShSTAT5b质粒的细胞可见绿色荧光表达,其中Pgenesil-1-ShSTAT5b转染可见大量绿色荧光表达。说明重组质粒得转染效率及表达量均较高。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,由条带亮度和宽度可见RNA无污染,纯度高,完整性好,无降解。沉默效应采用Pgenesil-1-ShSTAT5b转染U251细胞后,检测STAT5b和JAK1的mRNA水平及蛋白水平表达。结果Pgenesil-1-ShSTAT5b转染U251细胞后,干扰组STAT5b在mRNA水平及蛋白水平的表达均明显低于空白组及Pegenesil-1-HK组(表达抑制率大于90%)。而干扰组JAK在mRNA水平及蛋白水平的表达与空白组及Pegenesil-1-HK组比较均没有差异,证明Pgenesil-1-ShSTAT5b可以特异地沉默STAT5b。STAT5b沉默后,VEGF、survivin、bcl-2在RNA水平及蛋白水平的表达与空白和HK组比较均显著降低,而bax表达则显著高于空白组和HK组。另外,STAT5b沉默后,U251细胞的生长速度也明显低于空白组和HK组。U251细胞STAT5b沉默后,细胞的早期凋亡及晚期凋亡率均显著增加。说明STAT5b在神经胶质瘤的发生发展中可能具有非常重要的作用。结论STAT5b在神经胶质瘤组织及神经胶质瘤细胞系中呈过度活化及异常表达,JAK1/STAT5信号转导通路是神经胶质瘤的一条重要信号转导通路,STAT5b在胶质瘤JAK1/STAT5信号转导通路中处于结点地位。沉默STAT5b的表达可降低VEGF的表达,降低凋亡抑制基因bcl-2、survivin的表达水平,增加凋亡基因bax的表达。抑制STAT5b的过度表达可阻滞神经胶质母细胞瘤细胞U251的迅速生长,细胞的早期凋亡及晚期凋亡率均显著增加。以STAT5b为靶基因可为抗神经胶质母细胞瘤新药研发提供参考。