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目的: 辨证论治是中医理论的精华,方剂和证候是辨证论治的核心。本课题基于“方证相关”理论,运用全基因芯片分析的现代技术来探讨DMN诱导的湿(瘀)热内蕴证型的肝纤维化的病理机制,进一步阐述方证相关时,基因的修复遵循“无差错修复”原则的理论,研究茵陈蒿汤及其组分对DMN肝纤维化模型大鼠的基因调控作用,并阐明茵陈蒿汤及其组分抗肝纤维化的效应机制。 方法: 1.茵陈蒿汤及其组分配伍抗肝纤维化的药效学研究:制备二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝纤维化大鼠模型,在2周末肝纤维化形成期给予清热利湿功效的茵陈蒿汤、茵陈蒿汤组分干预治疗,4周末杀鼠取材。观察各组大鼠的一般情况、肝功能、组织病理及羟脯氨酸含量等指标,评判茵陈蒿汤及其组分干预治疗DMN诱导的肝纤维化疗效。 2.DMN大鼠肝纤维化模型的基因芯片数据的分析:对正常、2周模型、4周模型组的肝组织行全基因芯片检测。通过对基因表达水平的统计分析,筛选出差异倍数(Fold change)>2倍,P<0.05的差异基因。依据各个差异基因在不同时间点的表达浓度不同,进行趋势归类,筛选出肝纤维化形成和进展相关的趋势,分析其功能聚集。借助KEGG公共数据库对显著性差异基因进行pathway分析,然后利用pathway间的相关性构建gene-act-work,从中找出关键节点并予以RT-PCR验证。 3.茵陈蒿汤及其组分组基因芯片的分析:采用与步骤2同样的分析方法分析两个用药组,对筛选出的差异基因进行基因趋势、功能注释、Pathway的显著性分析,并根据KE GG据库利用Pathway构建Gene-act-work,从中找出两组药物抑制肝纤维化的关键节点基因,分析其节点的异同和意义,并进行RT-PCR验证 结果: 1.茵陈蒿汤及其组分组的药效学结果:与模型组比较,茵陈蒿汤及其组分组,肝重显著升高,腹水发生率显著降低,血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransfer ase,ALT)、血清天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminot ransfer ase,AST)活性和血清总胆红素(total bilirubin,TBiL)、羟脯氨酸(Hydroxyproline,hyp)含量均显著降低,血清白蛋白(albumin,ALB)含量显著升高(p<0.05或p<0.01);病理组织学显著改善。综合比较茵陈蒿汤组分组抑制肝纤维化效果优于茵陈蒿汤组。 2.DMN模型基因芯片数据分析:经过差异基因、GO富集分析,我们发现在肝纤维化发生发展过程中发挥显著作用的是具有抗原提呈、免疫应答、炎症反应、脂肪酸代谢等功能的基因。其中与炎症免疫相关基因表达显著上调,与脂肪酸代谢基因表达显著下调。进一步对与肝纤维化密切相关的富集GO的差异基因进行pathway分析,并利用通路间的关联性构建gene-act-work,结果显示在肝纤维发生过程中与炎症免疫相关的起关键作用的节点基因,分别为:CCR5、Cxcl10、Ccl5、Ccl3、Ccl2、Ccl19、Ccl21、Cx3cl1、Pf4、IL-1β、Irf5、Mefv、Gstm3、Actg1、Cd44、Prkcb、Fcgrla、Ccna2、Ncf1和Casp1等,且以造模开始至2周上调最显著。PCR验证相关基因,与基因芯片结果相符。 3.茵陈蒿汤组及茵陈蒿汤组分组基因分析:对差异基因根据各时间节点的基因值进行趋势归类,结果显示茵陈蒿汤组的有效基因趋势聚焦免疫应答、炎症反应、抗原加工处理、对脂多糖的应答等炎症免疫功能相关,且相关表达基因均显著下调。茵陈蒿汤组分的差异基因,经趋势分析后,发现炎症、免疫相关基因表达显著下调,同时脂肪酸代谢、甘油三酯代谢相关基因显著上调。构建gene-act-work发现,两用药组的共同关键节点基因与模型组关键节点基因重合主要集中在炎症免疫相关调控基因。对重合基因(CCR5、Cxcl10、Ccl5、Ccl3、Ccl2、Ccl19、Ccl21、Cx3cl1、Pf4、IL-1β、Irf5、Mefv、Gstm3、Actg1、Cd44、Prkcb、Fcgr1a、Ccna2、Ncf1和Casp1)进行RT-PCR验证,结果显示,用药后,重合关键节点基因表达与模型组比较,趋势正好相反,表现出一定的修复作用,且茵陈蒿汤组分组优于茵陈蒿汤组。 结论: 1.茵陈蒿汤、茵陈蒿汤组分能够显著地抑制DMN诱导的大鼠肝纤维化。 2.炎症反应、免疫应答和脂肪酸代谢功能网络失调是DMN诱导的大鼠肝纤维化发生的主要机制。 3.茵陈蒿汤和茵陈蒿汤组分遵循“方证相关时”,基因的修复遵循“无差错修复”原则理论,调控了DMN肝纤维化大鼠的炎症反应、免疫应答和脂肪酸代谢功能基因,使失调的网络得到无差错修复,从而有效抑制肝纤维化。