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目的:探讨M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M2,PKM2)与食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)临床恶性表型的相关性;验证微环境中PKM2对食管癌细胞恶性表型的功能影响;初步探讨食管癌微环境中PKM2表达参与的细胞调控通路。方法:(1)在组织水平,通过免疫组化方法检测PKM2在食管鳞癌癌组织及癌旁正常组织中的表达,分析PKM2与食管癌临床病理参数(患者年龄、性别,肿瘤浸润深度、淋巴结转移等)和预后的相关性。此外,运用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)验证PKM2在食管癌患者血清中的表达。(2)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qRT-PCR)检测不同食管癌细胞系中PKM2的本底表达量差异。设计合成三条不同的PKM2干扰序列,通过siRNA干扰技术敲低食管癌Eca109细胞中PKM2的表达,qRT-PCR技术检测siRNA瞬时转染后PKM2 mRNA表达水平的变化;Westem blot技术检测蛋白水平PKM2的表达改变;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖变化;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡及周期改变;细胞划痕实验检测对食管癌细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测对食管癌细胞侵袭能力的影响。(3)进一步选择干扰效率最高的siRNA序列设计合成携带GFP的干扰PKM2表达的慢病毒包装载体,同时设计合成携带GFP的PKM2过表达慢病毒包装载体,通过转染食管癌Eca109细胞、FCM分选得到稳定转染的干扰以及过表达PKM2的细胞株,MTT法验证细胞增殖变化,细胞划痕实验验证PKM2表达量改变对食管癌细胞迁移能力的影响,Transwell实验验证PKM2表达量改变对食管癌细胞侵袭能力的影响。(4)选取4~5周龄14~17g的雌性BALB/c Nude鼠,构建裸鼠异位移植瘤模型。采用PKM2干扰及过表达慢病毒包装载体稳定转染的食管癌Eca109细胞系,细胞计数后按2×107个细胞/0.2m L/鼠的剂量接种于裸鼠右侧后肢部皮下,接种后每周测量裸鼠体重并观察瘤块的生长情况。瘤块长出后,用游标卡尺测量裸鼠瘤块长径(A)及垂直横径(B),按公式V=A×B2/2计算裸鼠肿瘤体积。组织样本,福尔马林固定后制成石蜡包埋的组织样本,切片后进行HE染色及免疫组化染色,观察移植瘤组织形态并检测移植瘤组织中PKM2的表达。(5)为探讨PKM2调控食管癌恶性表型的机制,将PKM2 siRNA转染食管癌eca109细胞及kyse150细胞,正常培养的eca109细胞及kyse150细胞设为对照组,转染后48h收集细胞并提取总rna,明确pkm2sirna干扰效果后通过mrna表达谱芯片检测,分析基因的改变和信号通路变化。结果:(1)食管癌组织中pkm2阳性表达为在细胞胞浆中呈棕褐色着色,pkm2在食管癌组织中的表达(69/75,92.0%)明显高于其在配对癌旁正常组织中的表达(9/75,12.0%),差异有统计学意义(p<0.05)。kaplan-meier生存分析发现,与pkm2低表达的食管癌患者相比较,pkm2高表达的患者显示出生存时间较短的趋势(log-rank检验,p>0.05)。此外,检测哈族食管癌临床样本中pkm2的表达,发现:pkm2在食管癌组织中的表达(37/54,68.5%)明显高于其在配对癌旁正常组织中的表达(8/54,14.8%),差异有统计学意义(p<0.05)。通过kaplan-meier生存分析,显示:pkm2高表达的哈族食管癌患者其生存期明显短于pkm2低表达的哈族食管癌患者(log-rank检验,p<0.05),即pkm2高表达的哈族食管癌患者预后较差。食管癌患者血清中pkm2的表达(78.84ng/ml)显著高于正常对照人群血清中pkm2的表达(13.55ng/ml,p<0.05)。(2)在细胞水平检测不同食管癌细胞系中pkm2的本底表达量差异,结果发现在eca109、ec9706、kyse30、kyse150、kyse450及t46种细胞系中,kyse450细胞中pkm2表达量最高,其次是t4、ec9706、eca109、kyse150,kyse30细胞中pkm2表达量最低。为验证微环境中pkm2表达对食管癌细胞恶性表型的功能影响,通过设计、合成并瞬时转染pkm2sirna,结果发现三条pkm2sirna在mrna水平和蛋白水平均能显著敲低食管癌eca109细胞中pkm2的表达,其表达量改变与随机序列对照组(sirna-scramble)以及正常培养对照组(normalcontrol)比较均显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。通过pkm2sirna瞬时转染干扰pkm2表达后进行细胞功能学实验,mtt检测发现敲低pkm2的表达后食管癌eca109细胞增殖受到显著抑制,划痕实验和transwell侵袭实验发现eca109迁移能力和侵袭能力均显著降低,fcm检测发现敲低pkm2的表达后细胞凋亡增多,细胞周期被阻滞在g0/g1期。检测细胞功能变化,发现:sirna瞬时转染成功敲低pkm2的表达后,食管癌eca109细胞的增殖受到抑制,细胞凋亡增加,细胞侵袭、迁移能力显著下降,同时细胞周期被阻滞在g0/g1期。(3)为进一步明确pkm2表达对食管癌细胞功能的影响,采用慢病毒稳定转染pkm2基因并在体内验证该结果,本研究选择干扰效果最显著的sirna序列进一步设计合成干扰pkm2稳定表达的慢病毒包装载体,以及pkm2过表达慢病毒包装载体,根据细胞转染的慢病毒种类将实验分5组:干扰pkm2表达实验组(转染sirna-pkm2慢病毒包装载体)、干扰pkm2表达对照组(转染sirna-scramble慢病毒包装载体)、pkm2过表达实验组(转染pkm2过表达慢病毒包装载体)、pkm2过表达对照组(转染pkm2-scramble慢病毒包装载体)、阴性对照组(正常培养的eca109细胞)。通过转染干扰以及过表达pkm2的慢病毒载体改变pkm2的表达后,检测细胞功能变化,细胞增殖实验结果显示,干扰PKM2表达后食管癌Eca109细胞的增殖受到显著抑制,过表达PKM2促进了Eca109细胞的增殖;划痕实验结果发现,干扰PKM2表达后Eca109细胞的相对迁移距离减小,过表达PKM2后Eca109细胞的相对迁移距离增加;Transwell侵袭实验发现,干扰PKM2表达后侵袭细胞数显著减少,过表达PKM2后侵袭细胞数显著增多,即干扰PKM2表达抑制了食管癌Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭,过表达PKM2促进食管癌Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭。(4)在裸鼠皮下分别注射干扰、过表达PKM2的Eca109稳定转染细胞株一周后成瘤,注射干扰PKM2表达的Eca109细胞成瘤后组织低表达PKM2,注射过表达PKM2的Eca109细胞成瘤后组织高表达PKM2,此外,PKM2过表达后裸鼠皮下移植瘤体积大于对照组,统计分析结果显示两组之间平均瘤体体积差异有统计学意义(P<0.05),即过表达PKM2促进了裸鼠皮下移植瘤的生长。以上结果说明在体内PKM2的表达影响食管癌细胞的增殖。(5)mRNA表达谱芯片差异基因筛选常规标准为FC(abs)在2.0倍以上,按此标准,干扰PKM2表达后Eca109细胞中有4592个上调基因,2497个下调基因;干扰PKM2表达后KYSE150细胞中有1796个上调基因,1936个下调基因。干扰PKM2表达后Eca109细胞和KYSE150细胞中mRNA水平表达均上调的基因有298个,其中差异倍数大于5倍的基因共有16个;表达均下调的基因有277个,其中差异倍数大于4倍的基因共有8个。此外,Eca109细胞中干扰PKM2表达后受到影响的细胞功能和信号通路包括p53信号通路、自噬、蛋白质消化和吸收、补体系统以及化学致癌作用;KYSE150细胞中干扰PKM2表达后受到影响的功能和信号通路变化包括核糖体起源、N-聚糖生物合成、凋亡、TNF信号通路、Notch信号通路、DNA复制、细胞周期以及对转录的异常调控。结论:PKM2在食管癌中呈高表达,哈族食管癌患者高表达PKM2其预后差。PKM2高表达能促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移以及侵袭,抑制细胞凋亡,并影响细胞的周期分布。PKM2对食管癌细胞恶性表型的影响可能受p53信号通路、TNF信号通路和Notch信号通路等多种因素的调控。