骆驼刺中慢生根瘤菌Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2~T是本实验室从新疆荒漠地区疏叶骆驼刺根瘤中分离得到的具有优良抗逆性的菌株,最高能够耐受0.8 M NaCl。为了更好的研究其耐盐机制,本文使用RNA-Seq技术,研究其在不同盐浓度条件下转录组表达差异,然后选取部分差异表达基因,利用同源重组技术构建基因敲除突变体,对突变体表型进行检测,以进一步研究基因功能。转录组测序结果显示,以2倍为筛选差异表达基因的阈值,在高盐条件下,差异表达基因总数为1849个,占总注释基因数(7195)的25.7%。其中933个基因表达下调,916个基因表达上调。表达上调基因主要集中在氨基酸合成及转运、碳水化合物转运及代谢、能量代谢、核糖体合成、蛋白质翻译等代谢过程,说明在高盐条件下,M.alhagi XJ12-2~T的能量代谢水平和蛋白合成能力都有所提高。同时,大部分与抗氧化相关基因的表达有不同程度的升高,说明在高盐条件下,该菌的抗氧化能力有一定程度的提高。下调基因主要富集在膜转运相关代谢通路,该菌中几种常见的蛋白分泌系统,如第二套三型分泌系统(T3SS2)、四型分泌系统(T4SS)、六型分泌系统(T6SS)等的表达都有所下调。同时,在高盐条件下,大部分分子伴侣基因的表达量也有所降低。在1894个差异表达基因中,有653个基因被注释为假定蛋白,占差异基因总数的35.32%,说明在该菌的耐盐机制中,仍有许多未知的部分。综上所述,M.alhagi XJ12-2~T对盐胁迫的响应是一个复杂而又系统的过程,涉及大部分细胞代谢。通过转录组数据发现,在高盐条件下,M.alhagi XJ12-2~T有两套与甘氨酸甜菜碱/脯氨酸转运相关的proVWX操纵子的表达量显著上调。甘氨酸甜菜碱/脯氨酸作为常见的渗透保护物,广泛存在于微生物及植物中。本研究利用同源重组技术,构建这两套甘氨酸甜菜碱/脯氨酸转运系统的敲除突变体XJG1和XJG2,并对突变体的耐盐及抗氧化能力进行检测。结果表明两个突变体的盐耐受能力及抗氧化能力与野生型相比没有明显改变。这种情况有可能是由于该系统在M.alhagi XJ12-2~T中存在冗余所造成的,也可能是因为该菌能够从其他物质(如胆碱)合成甘氨酸甜菜碱/脯氨酸,从而抵消proVWX敲除所造成的影响。转录组数据显示,在高盐条件下第一套三型分泌系统(T3SS1)的表达显著上调,表明该系统有可能与M.alhagi XJ12-2~T的耐盐能力有关。于是本研究利用同源重组技术,构建ΔrhcQ,Δ0070及ΔT3三个基因敲除突变体来研究T3SS1在M.alhagi XJ12-2~T抗环境胁迫中的作用,其中rhcQ基因编码结构蛋白,0070编码假定的分泌蛋白,ΔT3为包括rhcQ在内的9个基因的敲除突变体。结果表明突变体ΔrhcQ和ΔT3的耐盐能力和抗氧化能力与野生型相比有明显的降低;突变体Δ0070与野生型相比,只对KCl的耐受能力有明显降低,对其他盐的耐受能力及抗氧化能力则没有明显的变化。进一步研究发现,三株突变体在高盐条件下细胞总钠离子和钾离子的含量要高于野生型,而且其抗氧化酶活力明显低于野生型,说明T3SS1对M.alhagi XJ12-2~T维持细胞内的离子稳态和抗氧化能力有一定的作用。在下调基因中,选取丝氨酸蛋白激酶基因(prkA)进行研究。丝氨酸蛋白激酶在微生物中广泛存在并且比较保守,在不同的微生物中发挥着不同的功能。利用同源重组技术,构建prkA基因敲除突变体,并对突变体的抗逆特性进行检测。结果表明,prkA基因的敲除,使菌株的盐耐受能力和抗氧化能力有了明显的提高。对细胞总Na+含量的测定结果显示,突变体与野生型细胞总Na+含量基本一致,说明prkA基因对该菌的Na+转运没有影响。而对抗氧化酶活力测定结果表明,突变体抗氧化酶活力与野生型相比有明显的提高,表明prkA基因能够通过影响M.alhagi XJ12-2~T中抗氧化酶活力来影响其耐盐能力。