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第一部分肺腺癌中ceRNA网络的构建及TWIST1-ceRNET与肺腺癌临床病理特征的关系研究
【背景】肺癌是发病率与病死率最高的恶性肿瘤，复杂的内源竞争性RNA(competingendogenous ceRNA)网络的相关研究已出现在包括肺腺癌的多种恶性肿瘤当中。迄今为止，绝大多数关于ceRNA网络的研究都将注意力集中于非编码RNA(ncRNA)，然而，mRNA的表达丰度要更高于长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，它们3’UTR区的保守性也高于lncRNA，且其数量庞大，构成了miRNA目标位点的最大比重。因此，可以想见的是，mRNA在RNA竞争抑制表达机制当中发挥了比lncRNA更为重要的作用。
【方法】我们通过Perl语言对miRBASE、Targetscan以及starbase这三个靶基因预测网站进行全面数据搜索，并取三个预测网站所有mRNA-miRNA组合的交集组成潜在的ceRNA组合网络。随后我们利用TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库RNAseq数据，使用R语言对于所有潜在ceRNA的mRNA-mRNA以及mRNA-miRNA的表达相关性进行全面筛选，挑选出所有符合mRNA-mRNA正相关，同时mRNA-miRNA负相关的ceRNA组合组成ceRNA调控网络。通过该调控网络和在肺腺癌当中差异表达的癌基因图谱比较，我们挑选出了以TWIST1为核心，包含SLC12A5以及ZFHX4的ceRNA网络(ceRNAnetworks, ceRNET)，随后我们将TWIST1、SLC12A5、ZFHX4以及其靶miRNA的表达相关性在TCGA数据库以及组织标本中的进行了初步验证。并通过带有临床病理信息及预后信息的临床芯片研究了TWIST1-ceRNET的表达与肺腺癌临床病理特征的关系。
【结果】我们以TargetScan,miRanda和Starbase三个网站所提供的microRNA-mRNA结合位点预测方法为基础，结合TCGA数据库所提供的miRNA-mRNA和mRNA-mRNA共表达关系分析，构建了mRNA-mRNA相关ceRNA网络。应用我院带有临床病例特征及随访数据的组织芯片进行染色和分析，我们发现TWIST1、SLC12A5及ZFHX4在分期较晚的肺腺癌组织中表达更高，在淋巴结转移的患者当中，表达也明显升高。进一步的生存分析显示，TWIST1、SLC12A5和ZFHX4高表达组的患者其总生存期较短。
【结论】本研究建立的肺腺癌mRNA-mRNAceRNA网络能够卓有成效的寻找潜在ceRNA组合。通过其发现的TWIST1-ceRNET在肺腺癌组织中得到了初步验证，且TWIST1-ceRNET的表达和淋巴结转移以及TNM分期直接相关，TWIST1、SLC12A5、ZFHX4高表达的病例其生存时间明显缩短。
第二部分TWIST1-ceRNET在肺腺癌中的表达特征及体内外的生物学功能研究
【背景】迄今为止，SLC12A5以及ZFHX4在肺腺癌当中的生物学功能尚不甚清楚。第一部分的研究成果表明，TWIST1、SLC12A5和ZFHX4可能组成ceRNA调控网络，共同参与肺腺癌的恶性进展过程。因此，本部分研究通过体内和体外实验探讨了TWIST1、SLC12A5和ZFHX4在肺腺癌当中的生物学功能。
【方法】在A549及H1299细胞中进行了CCK8、EdU，Tranwell和matrigel以及xCELLigence细胞功能仪实验。继而，我们采用小鼠荷瘤模型探究TWIST1-ceRNET对LAC细胞成瘤能力的影响。
【结果】CCK8、EdU实验结果证实敲减TWIST1/SLC12A5/ZFHX4降低肺腺癌细胞增殖速率能力，而过表达TWIST1/SLC12A5/ZFHX43’UTR区则提高了增殖速率。Tranwell、matrigel以及xCELLigence细胞功能仪实验实验证实敲减TWIST1/SLC12A5/ZFHX4之后LAC细胞迁移侵袭能力下降，而过表达TWIST1/SLC12A5/ZFHX43’UTR则促进LAC细胞的迁移侵袭能力。在小鼠荷瘤模型体内实验当中，相对于转染了NC的对照组，sh-TWIST1/SLC12A5/ZFHX4组在肿瘤生长速度和重量方面均明显受到抑制，该效果可以被miR-194-3pantagomirs/miR-514a-3pantagomirs逆转。
【结论】TWIST1-ceRNET相关基因上调可以在体内及体外促进肺腺癌的增殖、迁移、侵袭等恶性表型，且功效极大程度上依赖miR-194-3p以及miR-514a-3p。
第三部分TWIST1-ceRNET在肺腺癌中相互调节分子机制研究
【背景】在以上研究中，我们已经证实，TWIST1-ceRNET相关基因上调可以促进肺腺癌的增殖、迁移、侵袭等恶性表型，且功效极大程度上依赖其靶向miRNA，暗示TWIST1/SLC12A5/ZFHX4之间存在miRNA调控媒介。因此，本阶段实验中我们旨在研究TWIST1/SLC12A5/ZFHX4与miR-194-3p以及miR-514a-3p相互调节的分子机制。
【方法】通过RNA沉默、过表达技术分别上调或敲降TWIST1/SLC12A5/ZFHX4以及miR-194-3p、miR-514a-3p的表达，观察潜在靶基因RNA及蛋白层面的表达变化。用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、生物素标记的RNApulldown(biotin-pull down)、双荧光素酶报告基因等技术探索miR-194-3p以及miR-514a-3p对TWIST1/SLC12A5/ZFHX4进行调控的分子机制。
【结果】A549及H1299这两株代表性LAC细胞中，在mRNA及蛋白层面，敲降SLC12A5/ZFHX4后TWIST1明显下调，过表达SLC12A5/ZFHX43’UTR区域后TWIST1明显上调，且这种调节作用可以分别被miR-194-3p及miR-514a-3p的同向表达变化所稀释。在A549及H1299细胞中过表达或敲降miR-194-3p及miR-514a-3p，发现miR-194-3p可负向调节SLC12A5/TWIST1的表达，而miR-514a-3p可负向调节ZFHX4/TWIST1的表达。在Ago2RIP中，TWIST1/SLC12A5/ZFHX4以及miR-194-3p/miR-514a-3p都与AGO2蛋白充分结合。在biotin-pulldown中，miR-194-3p能富集到较多的TWIST1/SLC12A5，miR-514a-3p能富集到较多的TWIST1/ZFHX4。
【结论】SLC12A5和ZFHX4能够在肺腺癌细胞中正向调节TWIST1的表达，其作用分别依赖于miR-194-3p和miR-514a-3p。miR-194-3p能与SLC12A5/TWIST1结合，miR-514a-3p能与ZFHX4/TWIST1结合，直接负向调节其表达水平。
【背景】肺癌是发病率与病死率最高的恶性肿瘤，复杂的内源竞争性RNA(competingendogenous ceRNA)网络的相关研究已出现在包括肺腺癌的多种恶性肿瘤当中。迄今为止，绝大多数关于ceRNA网络的研究都将注意力集中于非编码RNA(ncRNA)，然而，mRNA的表达丰度要更高于长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，它们3’UTR区的保守性也高于lncRNA，且其数量庞大，构成了miRNA目标位点的最大比重。因此，可以想见的是，mRNA在RNA竞争抑制表达机制当中发挥了比lncRNA更为重要的作用。
【方法】我们通过Perl语言对miRBASE、Targetscan以及starbase这三个靶基因预测网站进行全面数据搜索，并取三个预测网站所有mRNA-miRNA组合的交集组成潜在的ceRNA组合网络。随后我们利用TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库RNAseq数据，使用R语言对于所有潜在ceRNA的mRNA-mRNA以及mRNA-miRNA的表达相关性进行全面筛选，挑选出所有符合mRNA-mRNA正相关，同时mRNA-miRNA负相关的ceRNA组合组成ceRNA调控网络。通过该调控网络和在肺腺癌当中差异表达的癌基因图谱比较，我们挑选出了以TWIST1为核心，包含SLC12A5以及ZFHX4的ceRNA网络(ceRNAnetworks, ceRNET)，随后我们将TWIST1、SLC12A5、ZFHX4以及其靶miRNA的表达相关性在TCGA数据库以及组织标本中的进行了初步验证。并通过带有临床病理信息及预后信息的临床芯片研究了TWIST1-ceRNET的表达与肺腺癌临床病理特征的关系。
【结果】我们以TargetScan,miRanda和Starbase三个网站所提供的microRNA-mRNA结合位点预测方法为基础，结合TCGA数据库所提供的miRNA-mRNA和mRNA-mRNA共表达关系分析，构建了mRNA-mRNA相关ceRNA网络。应用我院带有临床病例特征及随访数据的组织芯片进行染色和分析，我们发现TWIST1、SLC12A5及ZFHX4在分期较晚的肺腺癌组织中表达更高，在淋巴结转移的患者当中，表达也明显升高。进一步的生存分析显示，TWIST1、SLC12A5和ZFHX4高表达组的患者其总生存期较短。
【结论】本研究建立的肺腺癌mRNA-mRNAceRNA网络能够卓有成效的寻找潜在ceRNA组合。通过其发现的TWIST1-ceRNET在肺腺癌组织中得到了初步验证，且TWIST1-ceRNET的表达和淋巴结转移以及TNM分期直接相关，TWIST1、SLC12A5、ZFHX4高表达的病例其生存时间明显缩短。
第二部分TWIST1-ceRNET在肺腺癌中的表达特征及体内外的生物学功能研究
【背景】迄今为止，SLC12A5以及ZFHX4在肺腺癌当中的生物学功能尚不甚清楚。第一部分的研究成果表明，TWIST1、SLC12A5和ZFHX4可能组成ceRNA调控网络，共同参与肺腺癌的恶性进展过程。因此，本部分研究通过体内和体外实验探讨了TWIST1、SLC12A5和ZFHX4在肺腺癌当中的生物学功能。
【方法】在A549及H1299细胞中进行了CCK8、EdU，Tranwell和matrigel以及xCELLigence细胞功能仪实验。继而，我们采用小鼠荷瘤模型探究TWIST1-ceRNET对LAC细胞成瘤能力的影响。
【结果】CCK8、EdU实验结果证实敲减TWIST1/SLC12A5/ZFHX4降低肺腺癌细胞增殖速率能力，而过表达TWIST1/SLC12A5/ZFHX43’UTR区则提高了增殖速率。Tranwell、matrigel以及xCELLigence细胞功能仪实验实验证实敲减TWIST1/SLC12A5/ZFHX4之后LAC细胞迁移侵袭能力下降，而过表达TWIST1/SLC12A5/ZFHX43’UTR则促进LAC细胞的迁移侵袭能力。在小鼠荷瘤模型体内实验当中，相对于转染了NC的对照组，sh-TWIST1/SLC12A5/ZFHX4组在肿瘤生长速度和重量方面均明显受到抑制，该效果可以被miR-194-3pantagomirs/miR-514a-3pantagomirs逆转。
【结论】TWIST1-ceRNET相关基因上调可以在体内及体外促进肺腺癌的增殖、迁移、侵袭等恶性表型，且功效极大程度上依赖miR-194-3p以及miR-514a-3p。
第三部分TWIST1-ceRNET在肺腺癌中相互调节分子机制研究
【背景】在以上研究中，我们已经证实，TWIST1-ceRNET相关基因上调可以促进肺腺癌的增殖、迁移、侵袭等恶性表型，且功效极大程度上依赖其靶向miRNA，暗示TWIST1/SLC12A5/ZFHX4之间存在miRNA调控媒介。因此，本阶段实验中我们旨在研究TWIST1/SLC12A5/ZFHX4与miR-194-3p以及miR-514a-3p相互调节的分子机制。
【方法】通过RNA沉默、过表达技术分别上调或敲降TWIST1/SLC12A5/ZFHX4以及miR-194-3p、miR-514a-3p的表达，观察潜在靶基因RNA及蛋白层面的表达变化。用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、生物素标记的RNApulldown(biotin-pull down)、双荧光素酶报告基因等技术探索miR-194-3p以及miR-514a-3p对TWIST1/SLC12A5/ZFHX4进行调控的分子机制。
【结果】A549及H1299这两株代表性LAC细胞中，在mRNA及蛋白层面，敲降SLC12A5/ZFHX4后TWIST1明显下调，过表达SLC12A5/ZFHX43’UTR区域后TWIST1明显上调，且这种调节作用可以分别被miR-194-3p及miR-514a-3p的同向表达变化所稀释。在A549及H1299细胞中过表达或敲降miR-194-3p及miR-514a-3p，发现miR-194-3p可负向调节SLC12A5/TWIST1的表达，而miR-514a-3p可负向调节ZFHX4/TWIST1的表达。在Ago2RIP中，TWIST1/SLC12A5/ZFHX4以及miR-194-3p/miR-514a-3p都与AGO2蛋白充分结合。在biotin-pulldown中，miR-194-3p能富集到较多的TWIST1/SLC12A5，miR-514a-3p能富集到较多的TWIST1/ZFHX4。
【结论】SLC12A5和ZFHX4能够在肺腺癌细胞中正向调节TWIST1的表达，其作用分别依赖于miR-194-3p和miR-514a-3p。miR-194-3p能与SLC12A5/TWIST1结合，miR-514a-3p能与ZFHX4/TWIST1结合，直接负向调节其表达水平。