研究目的:1、分析Sema4A在乳腺癌(BCa)中的表达及调控特点;2、研究Sema4A在BCa细胞中的作用;3、Sema4A对在乏氧条件下对BCa细胞活性的影响。研究背景:BCa是女性最常见的恶性肿瘤之一,占癌症病例的25%,占癌症相关死亡率的15%。BCa是一种异质性疾病,细胞学类型复杂,这对诊断和治疗都是不小的挑战。信号素家族成员众多,其成员为分泌蛋白和膜结合糖蛋白,最初的研究证实它们与轴突引导和神经发育有关。信号素共有八个亚型,其中脊椎动物中的信号素是Ⅲ-Ⅶ亚型,信号素的Ⅲ亚型是分泌蛋白,信号素的Ⅳ-Ⅵ亚型是跨膜蛋白,信号素的Ⅶ亚型是与Glycosylphosphatidylinositol(GPI)连接的。后续的研究发现信号素还与骨分化、心血管发育、免疫反应调控有关,并且该家族成员的异常表达和活性会参与各类肿瘤的发生发展。信号素4A(Sema4A)是信号素家族成员之一,以跨膜形式存在。其胞外形态可被裂解,在细胞外表现为可溶性配体。Sema4A与组织器官发育过程相关,并且在成人的大脑、肺、肾、睾丸和脾脏中都有表达。研究显示,该分子可通过影响T细胞和巨噬细胞活性,从而参与多种疾病的病变过程,如病毒性毛细支气管炎、哮喘和视网膜退行性疾病。在类风湿性关节炎中,Sema4A在其滑膜组织和滑液中的表达量明显升高,并且其表达量受脂多糖的调控表达上调;外源性Sema4A刺激滑膜细胞和巨噬细胞可显著上调细胞内炎性因子的表达和分泌,并且该作用的发挥依赖于其受体PlexinB1;另外,Sema4A与NF-kappaB相互调控并形成正反馈路径促进滑膜细胞的炎性进展。在肿瘤方面的研究中,Sema4A促进阿霉素诱导的肝癌细胞上皮间充质转化,促进癌细胞的侵袭和转移能力。目前,Sema4A有七种已知的受体,其中包括Tim-2,NRP-1,Plexin B1,Plexin B2,Plexin B3,Plexin D1和ILT-4。最初的研究表明Plexin分子在非免疫细胞上表达,而Tim-2和LT-4的表达高度局限于活化的小鼠和人CD4+T细胞,而在小鼠Treg细胞上检测到NRP-1的表达。后来证明Plexin B1和/或D1在免疫系统的DC细胞、T细胞和Treg细胞中都有表达。Plexins 受体(Plexin A1-A4,Plexin B1-3,Plexin C1和Plexin Dl)和neuropilins 受体(Nrp1 and Nrp2)是信号素的主要受体。Sema4A与Plexins D1结合,支持血管内皮生长因子介导的内皮细胞迁移和增殖;Sema4A通过受体Plexins B1、B2或B3诱导细胞形态变化。此外,在T细胞(Treg)中Sema4A与neupilin-1的结合是调控T细胞(Treg)功能和稳定性所必需的。Sema4A与PlexinBs,Plexin D1,Nrp1,和Tim-2结合,每一种受体都发挥不同的功能。在小鼠模型中,Sema4A需要与Treg细胞表达的受体Nrp1结合来调控T细胞的功能和稳定性。在人类中淋巴组织与外周血相比,CD4+T细胞中NRP1表达高于外周血。类风湿关节炎患者滑膜液中和肌肉炎症患者滑膜液中均存在NRP+Treg。在一些癌症患者中,NRP1在Treg细胞中上调。Tim-2的表达高度局限于活化的T细胞。由于Sema4A结合诱导Tim-2细胞质尾部酪氨酸磷酸化,Tim-2转导Sema4A信号,并且Tim-2-和Sema4A缺陷小鼠表型相似,表明Tim-2是活化的T细胞上Sema4A的功能受体。综上,Sema4A及其受体参与调控的致病网络复杂并且具有细胞、组织和疾病特异性。Sema4A和肿瘤之间存在着密切的联系,Sema4A基因的种系变异可能导致家族性结直肠癌的发生。Sema4A在肝癌中能促进药物的耐药性。在BCa中,Sema4A可以通过与受体的相互作用调控BCa细胞的迁移,但是Sema4A的确切作用及其病理机制尚不清楚。本课题以BCa为疾病模型,探究其在该病进展过程中的潜在作用和相关机制,进一步丰富该家族成员与肿瘤学的研究提供数据支持。另外,乏氧在BCa病变过程中发挥非常重要的作用,该条件可通过乏氧诱导因子发挥作用,而后者作为转录因子可通过调控多种靶基因的表达,从而参与和导致疾病进展。本课题在明确Sema4A对BCa细胞活性的调控基础上,还将检测Sema4A与乏氧的关系,以及Sema4A是否参与调控乏氧条件下BCa细胞的活性。创新点及意义:1、本研究首次证明Sema4A在BCa细胞中的表达受乏氧调控,并且该作用依赖于乏氧诱导因子1alpha(HIF-1α);2、Sema4A可调控乏氧条件下的BCa细胞增殖和凋亡活性;3、外源性Sema4A可保护BCa细胞免于乏氧诱导的细胞凋亡;4、Sema4A可调控BCa细胞中多条信号通路的活性;5、Sema4A可作为BCa病变中的致病分子,影响病变进展。研究方法:1、探讨Sema4A在乳腺癌组织和细胞中的表达特点1.1荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测Sema4A在BCa组织中的表达收集BCa组织和周边正常组织,RT-qPCR和Western blot法检测其表达。1.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Sema4A在BCa患者和正常对照组血清中的表达。2、乏氧对Sema4A表达调控及潜在机制2.1体外乏氧条件下处理BCa细胞RT-qPCR和Western blot法检测Sema4A在BCa细胞中的表达;ELIS A法检测Sema4 A在BCa细胞培养上清中的表达。2.2 HIF-1α对Sema4A表达的调控在乏氧条件下,采用siRNA方法沉默HIF-1α及HIF-2α的表达,RT-qPCR法检测Sema4A在BCa细胞中的表达。2.3染色质免疫沉淀技术(ChIP)法检测HIF-1α是否结合在Sema4A基因启动子区。3、Sema4A对BCa细胞中乏氧相关分子表达的调控3.1 ELISA法检测BCa细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)的分泌量;3.2 Western blot法检测BCa细胞中MAPK(丝裂原活化蛋白激酶),Akt(蛋白激酶B)和STAT3(信号传导及转录激活蛋白转录激活因子)等通路总蛋白和磷酸化蛋白的表达变化。4、Sema4A对乏氧条件下乳腺癌细胞活性的影响4.1在乏氧条件下,沉默BCa细胞中Sema4A的表达:MTS法检测细胞增殖活性;Annexin V法检测细胞凋亡。4.2在乏氧条件下,将外源性Sema4A处理BCa细胞:MTS法检测细胞增殖活性;Annexin V法检测细胞凋亡。研究结果:1.Sema4A在BCa组织中的表达明显增加检测Sema4A在BCa组织及周边正常组织中的表达水平,发现BCa组织中Sema4A的表达在mRNA水平和蛋白质水平上高于相应的周边正常组织。采用ELISA法检测BCa患者血清中Sema4A的表达。结果表明,BCa患者血清中Sema4A表达明显高于健康对照组。2.缺氧通过HIF-1α依赖途径诱导BCa细胞中Sema4A的表达缺氧(1%和0.2%O2)可诱导BCa细胞中Sema4A的表达上调。缺氧刺激后,细胞上清液中Sema4A的水平也上调。我们随后分析了 HIF-1α和HIF-2α敲除对BCa细胞中Sema4A表达的影响。沉默HIF-1α,而不是HIF-2α,可以抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中Sema4A的基础表达水平。值得注意的是,低氧(1%O2)诱导BCa细胞产生的Sema4A可以被si-HIF-1 α减弱,而si-HIF-2α则不能。我们还分析了 Sema4A在BCa细胞上清液中的表达。与BCa细胞内源性Sema4A的表达变化一致,缺氧(1%O2)刺激后可溶性Sema4A显著升高,而沉默HIF-1α可以拮抗缺氧诱导的表达上调。为进一步验证HIF-1α对Sema4A的影响,我们应用Jaspar软件预测了 HIF-1α与Sema4A基因启动子的潜在结合。其次,对MDA-MB-231和MCF-7细胞进行了 ChIP-qPCR,发现HIF-1α可以结合在Sema4A转录起始点-697 bp--70 6 bp的位置。重要的是,缺氧刺激后,HIF-1α结合在该区域的量明显增加。3.BCa细胞的缺氧活性需要Sema4A我们测定了 Sema4A对BCa细胞缺氧活性的影响。数据显示,由于低氧治疗,VEGF的生成和MAPK,Akt和STAT 3等通路磷酸化水平在MDA-MB-231和MCF-7细胞显著增加。然而,沉默Sema4A可以减轻低氧刺激引起的上述增加。然后我们检测了人重组Sema4A(rhSema4A)对缺氧条件下VEGF表达的影响。发现rhSema4A联合低氧处理与单独缺氧处理相比,可增加VEGF的生成以及ERK(细胞外信号调节激酶)、Akt和STAT3等通路的磷酸化水平。在缺氧条件下,沉默Sema4A抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。也就是说,在沉默Sema4A的BCa细胞中给予乏氧刺激,发现沉默Sema4A表达可显著抑制BCa细胞的增殖活性,而该抑制效应在乏氧条件下更为明显。然后,我们测定了在缺氧(0.2%O2)条件下,Sema4A对细胞凋亡的影响。AnnexinV数据显示,沉默Sema4A对正常条件下的细胞凋亡无明显影响。然而,在缺氧的情况下,虽然单独的低氧刺激也能诱导细胞凋亡,当Sema4A基因敲除后细胞凋亡显著增加4.rhSema4A对缺氧诱导的BCa细胞凋亡具有保护作用为探讨可溶性Sema4A对BCa细胞中的作用,我们应用rhSema4A检测其对BCa细胞生物学活性的影响。结果表明,rhSema4A对BCa细胞增殖具有促进作用,并且在1%02刺激下,可进一步促进BCa细胞增殖。我们还使用了严重的低氧(0.2%O2)诱导细胞凋亡,观察rhSema4A对细胞凋亡的影响。结果表明,rhSema4A能抵抗缺氧诱导的细胞凋亡。结论:1、Sema4A在BCa细胞中受乏氧-HIF1α表达的调控。2、Sema4A可调控乏氧条件下的BCa细胞活性。3、外源性Sema4A可保护BCa细胞免于乏氧诱导的细胞损伤作用。4、本研究提示,Sema4A在缺氧条件下可促进乳腺癌的进展,提示我们Sema4A有可能成为治疗BCa的潜在靶点。