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背景重症肺炎目前具体的发病机制不详。研究发现重症肺炎患者淋巴细胞显著减少,并与患者的预后密切相关。是什么导致重症肺炎淋巴细胞减少?研究表明重症肺炎患者外周血中协同刺激分子表达异常,可能导致T淋巴细胞处于“免疫无能(anergy)”状态。其中是因为T淋巴细胞相关的协同刺激分子CD28,CD152及CD86等的表达异常,还是因为CD28/CD152这对相互拮抗的信号分子的比例异常导致了T淋巴细胞处于“免疫无能”状态?目前尚不清楚。研究发现胸腺肽-α1(Tα1)在机体免疫应答过程中起着重要的作用,并认为其可能是通过增强T淋巴细胞功能而调节免疫系统的。研究观察到胸腺肽a1可以改善脓毒性休克患者的T淋巴细胞增殖,调节机体的细胞免疫功能。可见,胸腺肽a1有调节机体免疫异常的功能,是否通过调控协同刺激信号来影响T淋巴细胞的增殖?尚待进一步的研究。目的在蛋白水平上研究重症肺炎T细胞相关协同刺激分子与其细胞增殖能力的关系,以探讨该病的发病机制;在此基础上,观察胸腺肽-α1对重症肺炎T淋巴细胞协同刺激分子及其细胞增殖能力的影响,并进一步探讨T淋巴细胞协同刺激分子在重症肺炎免疫异常中的可能作用。资料和方法1标本来源2007年8月一2008年06月入住广州市第一人民医院呼吸科的重症肺炎患者,均符合美国胸科学会(ATS)于2007年制定的重症肺炎诊断标准。健康对照组来自同期门诊健康体检者。经本人及家属知情同意后抽取外周静脉血。重症肺炎患者21例,抽血2mL,EDTA-K3抗凝;其中11例多抽血13mL,肝素抗凝;另外其中11例于住院治疗后10天再次抽血2mL(其中28天患者预后为8例好转、3例死亡)。健康人12名抽血2mL,EDTA-K3抗凝;其中10名多抽血8mL肝素抗凝。2方法2.1 T淋巴细胞相关协同刺激分子的检测:取EDTA-K3抗凝血标本。设测定管及同型对照管。检测T淋巴细胞上的四个表位(CD4, CD8, CD28, CD152)及相关的单核细胞的两个表位(CD86,HLA-DR)。用FITC、PE、PC5、APC和APCcy7荧光素直接标记单克隆抗体。检测前校准流式细胞仪的光路和液路。将光路调整至最佳,检测阴性对照,调整电压和颜色补偿。利用FACScan及CELLQuest软件收集分析数据。使用前向角散射光侧向角散射光双参数设门。收集10000个细胞。以百分率表示每群细胞的表达。2.2 T淋巴细胞的增殖试验2.2.1人外周血单个核细胞(PBMC)提取:密度梯度离心法提取重症肺炎病人及健康人的外周血标本(PBMC)。立即使用或冻存,用前溶解。2.2.2单个核细胞(PBMC)PKH26染色及培养:参考PKH26染料说明书对PBMC进行染色。重悬成1×106 / ml的浓度,接种于24孔培养板孔中。实验分为4组:①空白对照组PBS+PKH26染色后PBMC;②阳性对照组PHA+PKH26染色后PBMC;③胸腺肽-α1+内毒素+PKH26染色后PBMC;④内毒素PKH26+染色后PBMC。每孔终体积约0.6 ml浓度1×106 / ml,在37℃、5 %CO2条件下培养5天。2.2.3 T淋巴细胞增殖的检测:取出培养5天后的PKH26染色细胞,分两管,每管0.3ml ,离心洗涤,加入荧光素标记的PC5—CD3 1μg/ 106细胞,混匀后室温暗处孵育,洗涤后,用2 g/L多聚甲醛固定,利用流式细胞仪检测及数据用CELLQuest软件和ModFitTM软件分析得到T淋巴细胞的增殖指数(PF)及增殖细胞的前体频率(PI)。2.2.4体外培养T淋巴细胞及协同分子的检测:取未染色的单个核细胞,重悬成1×106 / ml的浓度,接种于24孔培养板孔中。实验分为4分组:①空白对照组PBS+未染色PBMC;②阳性对照组PHA+未染色PBMC;③胸腺肽-α1+内毒素+未染色PBMC;④内毒素+未染色PBMC。每孔终体积约0.6 ml,浓度1×106 / ml,在37℃、5 %CO 2条件下培养5天。取出培养5天后未染色的细胞,分两管,每管0.3ml ,离心洗涤,加入荧光素标记的FITC—CD28/PE—CD152/PC5—CD3各1μg/ 106细胞,混匀后室温暗处孵育,洗涤后,用2 g/L多聚甲醛固定,利用流式细胞仪检测及数据用CELLQuest软件分析协同刺激分子CD28、CD152的表达。2.3统计学方法:所有实验数据均用SPSS 11.5软件分析,计量资料以均数士标准差(士S)表示,两组均数比较采用t检验。随机区组设计资料采用方差分析,用LSD法进行数据间的多重比较,取P<0.05差异有统计学意义。结果1重症肺炎T淋巴细胞、亚群及相关协同刺激分子:21例重症肺炎患者CD3、CD4、CD86、HLA-DR、CD28/ CD152、CD4/CD8较12例健康对照组减少,有统计学显著性差异(P <0.05);CD8、CD28,CD152表达较健康对照组增加,有统计学显著性差异(P <0.05)。2 28天存活组重症肺炎患者治疗前后(10天)T淋巴细胞、亚群及相关协同刺激分子的变化:存活组8例重症肺炎入院第10天和第1天比较APACHEⅡ评分显著减少(P=0.000);CD28、CD152、CD86、HLA-DR的表达显著升高(P <0.05);CD3T细胞也显著增加(P=0.030);CD8CD3,CD4CD3阳性的T细胞无显著变化(P >0.05)。3 PKH26标记重症肺炎患者外周血单个核细胞(PMBC)的情况: PKH26标记PMBC,在直方图上PKH26荧光强度出现明显右偏,达104,呈单峰,阳性率为96.48%。荧光显微观察PKH26标记后的PMBC,可见其细胞发红色荧光。4重症肺炎患者外周血T淋巴细胞对抗原刺激的增殖能力:10例重症肺炎患者外周血T淋巴细胞对内毒素(LPS)刺激的增殖指数PI(1.55±0.42)与增殖细胞的前体频率PF(0.02±0.01)低于10例健康人组的PI (2.15±0.29)与PF(0.04±0.02),有统计学差异(P <0.05)。5胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响5.1光学显微镜观察胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响:不同干预因素组重症肺炎外周血T淋巴细胞在体外培养5天后,用显微镜观察(×10倍),可见PHA组及胸腺肽-α1加内毒素组出现明显的淋巴细胞母细胞化,其他两组未见明显的淋巴细胞母细胞化。5.2胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞增殖的影响:10例重症肺炎PHA组、胸腺肽-α1加内毒素组及内毒素组T淋巴细胞的增殖细胞的前体频率(PF)分别为:0.03±0.03、0.03±0.02、0.02±0.01;T淋巴细胞的增殖指数(PI)分别为:1.68±0.49、1.84±0.53、1.55±0.42。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞的增殖指数与增殖细胞的前体频率比内毒素组的高,有统计学显著性差异(P <0.05);胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞的增殖指数及增殖细胞的前体频率与PHA组的比较,无统计学显著性差异(P >0.05)。6胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞协同刺激分子的影响6.1胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞CD28协同刺激分子的影响: PBS组(67.40±6.45)%、PHA组(72.21±7.05)%、胸腺肽-α1加内毒素组(73.70±8.66)%及内毒素组(66.94±11.85) %。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD28协同刺激分子的表达比内毒素组及PBS组的高,有统计学显著性差异(P <0.05);胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD28协同刺激分子的表达与PHA组的比较,无统计学显著性差异(P=0.479)。6.2胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞CD152协同刺激分子的影响: PBS组(3.01±1.08)%、PHA组(2.69±1.23)%、胸腺肽-α1加内毒素组(2.41±0.77)%及内毒素组(2.86±1.03) %。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD152协同刺激分子的表达比内毒素组及PBS组的低,有统计学显著性差异(P <0.05);胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞CD152协同刺激分子的表达与PHA组的比较,无统计学显著性差异(P=0.306)。6.3胸腺肽-α1对重症肺炎外周血T淋巴细胞协同刺激分子CD28/CD152比值的影响: PBS组(25.26±9.57)、PHA组(31.38±11.67)、胸腺肽-α1加内毒素组(33.30±9.96)及内毒素组(21.13±5.39)。胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞协同刺激分子CD28/CD152的比值比内毒素组及PBS组的大,有统计学显著性差异(P <0.05);胸腺肽-α1加内毒素组T淋巴细胞协同刺激分子CD28/CD152的比值与PHA组的比较,无统计学显著性差异(P=0.490)。结论1.重症肺炎患者外周血T淋巴细胞存在“免疫无能”,导致了T淋巴细胞及CD4亚群减少,抑制了机体的免疫功能。2. T淋巴细胞相关协同刺激分子CD28、CD152及CD86表达异常参与了重症肺炎发病的病理生理过程。3.体外胸腺肽-α1可通过调节重症肺炎患者外周血T淋巴细胞协同刺激分子CD28、CD152表达;来改善其对抗原刺激的增殖能力。